Di truyền Vi sinh vật

I. DẪN NHẬP : VAI TRÒ CÁCH MẠNG HÓA VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM Mãi đến những năm 1940, các đối tượng vi sinh vật mới bắt đầu được sử dụng vào nghiên cứu di truyền học. Tuy ra đời chậm, nhưng các phát minh quan trọng có tính cách mạng trong sinh học như chứng minh trực tiếp DNA là vật chất di truyền, sao chép DNA, sinh tổng hợp protein, kỹ thuật di truyền,... đều thực hiện trên các đối tượng vi sinh vật. Do vậy, có thể nói di truyền học vi sinh vật đã đóng vai trò “cách mạng hóa” tạo ra những bước tiến nhảy vọt cho di truyền học nói riêng, hình thành Sinh học phân tử và sự phát triển Sinh học hiện đại nói chung cả về phương diện lí thuyết cũng như ứng dụng thực tiễn. Di truyền học của vi sinh vật đã góp phần chủ yếu cho sự phát triển di truyền học phân tử, mà đỉnh cao chói lọi là sự ra đời của kỹ thuật tái tổ hợp DNA hay kỹ thuật di truyền (KTDT), làm bùng nổ Cách mạng Công nghệ sinh học. 1. VAI TRÒ CÁCH MẠNG HÓA Nhân loại đang sống ở cuối thập niên đầu tiên của thế kỉ 21 – thế kỉ Công nghệ sinh học. Di truyền học đi sâu vào các vấn đề cơ bản của sự tồn tại và lưu truyền sự sống nên nó giữ một vị trí quan trọng đặc biệt, có người ví "Di truyền học là trái tim của Sinh học", vì không ít thì nhiều nó liên quan và chi phối bất kì lĩnh vực nào của sinh học, từ các cơ chế phân tử của sự sống cho đến sự tiến hóa của toàn bộ thế giới sinh vật trên hành tinh của chúng ta. Những phát minh lớn với số lượng tăng vọt của di truyền học đã có tác dụng cách mạng hóa sinh học, biến sinh học từ mô tả thành thực nghiệm chính xác. Hội nghị Di truyền học thế giới ở Toronto (Canada) năm 1988 đã nêu phương châm "Di truyền học hóa" Sinh học. Suốt thế kỉ XX, các nghiên cứu tập trung giải quyết vấn đề gen dẫn đến Thời đại gen, Cách mạng di truyền, mà đỉnh cao là việc hoàn tất Bộ gen người vào năm 2003 và mở ra Thời đại sau Bộ gen (Post-Genomics Era). Các đối tượng vi sinh vật đã góp phần chủ yếu vào các phát minh nền tảng không những của di truyền học phân tử, mà của sinh học phân tử và sinh học hiện đại nói chung. Điểm qua lịch sử các phát minh của sinh học phân tử sẽ thấy rõ vai trò cách mạng hóa của các đối tượng này. 1.1. Giả thiết 1 gen – 1 enzyme Vào năm 1941, G. Beadle và E. Tatum tiến hành thí nghiệm trên vi nấm mốc vàng cam bánh mì Neurospora crassa. Công trình chứng minh mối liên hệ giữa gen và tính trạng thông qua kiểm sóat các enzyme – protein và qua đó kiểm sóat các phản ứng sinh hóa trong tế bào. Giả thuyết này mở ra một trang mới về mối quan hệ chức năng giữa gen và enzyme trong con đường trao đổi chất của cơ thể. Phát minh có ý nghĩa quan trọng : bước chuyển tiếp từ di truyền học cổ điển sang di truyền phân tử. Do vậy, hai ông đã nhận giải Nobel vào năm 1958. 1.2. Các chứng minh trực tiếp rằng DNA là vật chất di truyền Ngay sau khi các định luật của Mendel được phát minh lại vào năm 1900, di truyền học đã phát triển rất nhanh với thuyết di truyền NST và nhiều thành tự khác như gây đột biến nhân tạo,... Tuy nhiên cho đến 1940, vẫn chưa có một bước tiến triển nào trong hiểu biết bản chất hoá học của vật liệu di truyền và chưa hiểu được bằng cách nào gen trên NST biểu hiện ra tính trạng. Trong một thời gian dài, mặc dù có nhiều số liệu gián tiếp cho thấy DNA là vật chất di truyền, nhưng protein vẫn được coi là thành phần chủ yếu của vật liệu di truyền vì nó có cấu trúc phân tử khá phức tạp. Do vậy, các chứng minh trực tiếp trên các VSV có ý nghĩa quyết định trong xác nhận vai trò của DNA. 1.2.1 Biến nạp : truyền thông tin di truyền nhờ DNA. Vào năm 1928, hiện tượng biến nạp (transformation) được Griffith phát hiện ở vi khuẩn Diplococus pneumoniae (nay gọi là Streptococus pneumoniae. Năm 1944, T.Avery, Mc Leod và Mc Carty đã xác định rõ tác nhân gây biến nạp là DNA. Hiện tượng biến nạp là chứng minh trực tiếp đầu tiên xác nhận rằng DNA mang tín hiệu di truyền. 1.2.2. Sự xâm nhập của DNA virus vào vi khuẩn. Năm 1952, A.Hershey và M.Chase đã tiến hành thí nghiệm với bacteriophage T2 (virus của vi khuẩn hay gọi tắt là phage) xâm nhập vi khuẩn E. coli, chứng minh trực tiếp rằng DNA của phage T2 đã xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sinh sản tạo ra thế hệ phage mới mang tính di truyền có khả năng tiếp tục nhiễm các vi khuẩn khác. Kết luận : Vật chất di truyền của phage T2 là DNA. Vào năm 1952 nhiều cuộc tranh cãi sôi nổi đã diễn ra về vai trò của DNA là vật chất di truyền . Sau đó, năm 1953 mô hình Waston và Crick đã đặt dấu chấm hết giai đoạn nghi ngờ DNA là vật liệu di truyền. .Các chứng minh trực tiếp nêu trên là những tiền đề quan trọng cho phát minh ra mô hình cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA của Waston và Crick đã tạo nên bước phát triển mới cho sinh học dẫn đến sự hình thành sinh học phân tử hiện đại. 1.3. Chi tiết hóa học thuyết trung tâm của sinh học phân tử : DNA –> RNA –> Protein 1.3.1. Sao chép DNA – Trong năm 1955, A. Kornberg và đồng sự đã phân lập DNA polymerase I từ vi khuẩn E. coli. Sau khi cho enzyme này vào ống nghiệm muối chứa DNA và 4 loại nucleotide triphosphate, hỗn hợp này có thể tổng hợp mạch DNA mới. – Năm1958, ở E. coli M.Meselson và F. Stahl đã chứng minh DNA sao chép theo cơ chế “bán bảo tồn” : mỗi mạch bố mẹ sẽ làm khuôn cho sự tổng hợp mạch DNA mới. Cho đến nay, toàn bộ chi tiết về sao chép DNA được thực hiện ở E. coli. 1.3.2. Các quá trình phiên mã, dịch mã và điều hòa tổng hợp protein Trên đối tượng E. coli đã khám phá : – Năm 1961: S. Brenner, Fr. Jacob và M. Meselson đã khám phá mRNA là phân tử mang thông tin di truyền của DNA từ nhân đến bộ máy sản xuất protein nằm trong tế bào chất. Điều này bác bỏ giả thuyết của Fr. Crick nêu ra năm 1958 cho rằng RNA của ribosome là phân tử trung gian mang thông tin di truyền từ nhân sang tế bào chất. – 1961 – 1966 : Mã di truyền được khám phá. Giải Nobel – Ngoài 2 phát minh trên, toàn bộ các quá trình phiên mã, dịch mã, cấu trúc của ribosome đều thực hiện trước tiên trên E. coli. – 1962 : Phát hiện cơ chế điều hòa sinh tổng hợp protein ở Operon lactose.Giải Nobel – 1970 : Phát hiện enzyme Reverse transcriptase. Giải Nobel 1.4. Những đóng góp cụ thể của các đối tương mô hình chủ yếu Việc tìm hiểu những đóng góp cụ thể của các đối tượng mô hình chủ yếu sẽ giúp hiểu rõ một cách hệ thống và cụ thể hơn về vai trò “cách mạng trong cách mạng” của di truyền VSV. 1.4.1. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) – Các đóng góp chủ yếu : Đối tượng chủ yếu cho các nghiên cứu : Sao chép, phiên mã, dịch mã và tái tổ hợp. Đột biến Điều hòa biểu hiện gen (Gene regulation). Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recmbinant DNA technology). – Đóng góp cho nghiên cứu các lĩnh vực khác : Trao đổi chất của tế bào (Cell metabolism), gen ức chế vô nghĩa (Nonsense suppressors), sự tuyến tính (Colinearity) giữa gen và polypeptide, các Operon, sự đề kháng thuốc dựa vào plasmid (Plasmid-based drug resistance) và sự vận chuyển tích cực (Active transport). 1.4.2. Nấm men Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) – Vai trò chủ yếu cho các nghiên cứu : Chu trình tế bào (Cell cycle) : Sự xác định các gen kiểm soát phân bào nhờ các đột biến nhạy cảm nhiệt (temperature-sensible mutants (cdc mutants)) dẫn đến mô hình rất tốt cho nghiên cứu sự phân bào. Tương tác gen (Gene interaction) : nghiên cứu sự ức chế gen (suppression). Hệ thống plasmid lai kép (two-hybrid plasmid system) giúp tìm các tương tác giữa các protein ở nấm men đã dẫn đến các bản đồ tương tác phức tạp, mà là khởi đầu cho sinh học các hệ thống (systems biology). Di truyền học ty thể : nhờ các đột biến “petite” mất khả năng hô hấp mà phát hiện các gen của ty thể. Nhờ chúng và các đột biến khác của ty thể mà phân tích chi tiết cấu trúc và chức năng bộ gen ty thể. Di truyền học kiểu bắt cặp (Genetics of mating type) : Các allele MAT ở nấm men là các gen kiểu bắt cặp đầu tiên được xác định các đặc tính ở mức phân tử. – Đóng góp khác : Sự di truyền của khóa dóng mở (switching) giữa sự tăng trưởng kiểu nấm men (yeast-like) và sợi (filamentous); di truyền học sự thoái hóa (senescense). 1.4.3. Mốc vàng cam Neurospora crassa – Các đóng góp chủ yếu : Di truyền sinh hóa và trao. đổi chất. Di truyền học của giảm phân. Di truyền ty thể. – Đóng góp khác : sự đa dạng các loài nấm và thích nghi ()adaptation, di truyền tế bào (cytogenetics), các gen kiểu bắt cặp, các gen dung hợp thể dị nhân (heterokaryon-compatibility genes). 1.5. Kỹ thuật di truyền và sự mở đầu cách mạng Công nghệ Sinh học 1.5.1. Enzyme hạn chế (restriction endonuclease) : Năm 1962, W.Arber lần đầu tiên chứng minh rằng có những enzyme đặc biệt hạn chế (restriction) sinh sản của phage trong tế bào E. coli. Năm 1968: Enzyme cắt giới hạn đầu tiên được khám phá: EcoR I. Đến năm 1970, Hamilton Smith và cộng sự đã tách ly được enzyme cắt giới hạn mới từ Haemophilus influenzae, gọi là Hind II. Enzyme này là công cụ đầu tiên trong kỹ thuật di truyền. Giải Nobel 1.5.2. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp : Năm 1972, nhóm của Paul Berg tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp in vitro đầu tiên từ ba nguồn khác nhau : nguyên bộ gen virus SV 40 gây ung thư ở khỉ, một phần bộ gen của phage và các gen của operon lactose của E. coli. Năm 1973, nhóm Cohen, Helenski, Boyer đã lần đầu tiên thâu nhận được các sản phẩm có hoạt tính từ DNA tái tổ hợp ở E. coli. Giải Nobel 1.5.3. Sản xuất protein tái tổ hợp : Năm 1977 được xem là năm mở màng cho kỷ nguyên của công nghệ sinh học khi lần đầu tiên hormon tăng trưởng ở người somatostatin được sản xuất thành công bằng con đường tái tổ hợp gen vào vi khuẩn.E. coli. Năm 1978, sản xuất insulin người đầu tiên do công nghệ gen. 1.5.4. Genomics : Sự xác định chính xác trình tự (sequencing) từng nucleotide của DNA hay gọi ngắn là giải kí tự chuỗi (sequencing) thành công ở các vi sinh vật và bộ gen người đã tạo nên khoa học về bộ gen gọi là genomics (genome - bộ gen) hay bộ gen học. Genomics giúp xác định nhanh chóng trình tự nucleotide của DNA bộ gen và các chức năng của chúng. Những sinh vật được hoàn tất giải ký tự chuỗi đầu tiên cũng là các VSV. – 1995 : 2 vi khuẩn, cũng là 2 sinh vật có cấu tạo tế bào đầu tiên được hoàn tất giải ký tự chuỗi (sequencing) bộ gen là Haemophillus influenza và Mycoplasma genitallum. – Tháng 5/1996, nấm men Saccharomyces cerevisiae, sinh vật Eukaryotae đầu tiên được giải ký tự chuỗi hoàn tất. – Tháng 9/1997: đăng tải trình tự bộ gen hoàn chỉnh của E. coli. Toàn bộ việc giải ký tự chuỗi DNA ở tất cả các sinh vật, kể cả Bộ gen người đều sử dụng các công cụ từ các VSV như enzyme cắt hạn chế, vector plasmid tạo dòng, NST nhân tạo nấm men (YAC) và vi khuẩn (BAC). 1.6. Sự hấp dẫn đối với các nhà vật lý và hóa học Di truyền học hiện đại đã hình thành những phương pháp phân tích di truyền (methodes of genetic analysis) cho phép phát hiện các quá trình sinh học của tính di truyền và biến dị đến cấp độ phân tử và nguyên tử, tức những phạm trù nghiên cứu chủ yếu của vật lý và hóa học. Các vi sinh vật như vi nấm, vi khuẩn và phage đã đóng vai trò quyết định trong vấn đề này. Dĩ nhiên, sự nhận thức các quá trình di truyền ở cấp độ phân tử chỉ trở thành hiện thực sau phát minh chuỗi xoắn kép DNA. Nhiều người cho rằng vai trò hàng đầu trong sự hình thành di truyền học phân tử là việc sử dụng rộng rãi các phương pháp vật lý và hóa học. Vật lý và hóa học đã và đang đóng vai trò quyết định trong các nghiên cứu những cơ chế phức tạp và mối quan hệ của bộ gen với các quá trình sinh tổng hợp trong tế bào. Tuy nhiên ý nghĩa căn bản của các quan niệm di truyền phân tử là sự tăng vọt năng lực phân giải di truyền (genetic resolving power) nhờ việc sử dụng các vi sinh vật. Vì thế có thể nói rằng sự phát triển các quan niệm di truyền phân tử trở thành hiện thực nhờ di truyền học vi sinh vật. Đánh giá vai trò của các nhà vật lý học trong sự phát triển của di truyền học phân tử, có thể phân họ thành 2 nhóm. Một nhóm của họ tham gia trực tiếp vào các thí nghiệm di truyền vi khuẩn và bacteriophage (Delbruck, Benzer, Fris, Levental,…) và họ đã thực hiện nhưng công trình rất thú vị, tuy nhiên họ không tạo ra phương pháp nào mới trong phân tích di truyền (genetic analysis). Sự tham gia của họ vào di truyền học rất có lợi nhờ nguồn sáng tạo của tư duy vật lý. Nhóm các nhà vật lý khác tham gia vào di truyền học bằng các “suy diễn trí tuệ” và ít có đóng góp cho di truyền học phân tử. Trên thực tế, mầm móng của di truyền học phân tử đã chứa đựng ngay trong học thuyết về gen của Mendel, trong các nguên lý di truyền nhiễm sắc thể của Morgan. Trong những năm 1940, một giai đoạn mới của di truyền học bắt đầu. Vào thời điểm này một nhóm các nhà khoa học quan tâm đến bản chất của gen. Phần lớn họ là các nhà vật lý học, họ khác các nhà di truyền học cổ điển cả về tư duy lẫn định hướng. Đa số các ‘tân binh’ này rất ít biết về những thành tựu di truyền học trong vài thập niên trước đó, thậm chí cả sinh học nói chung. Sự quan tâm của họ đến sinh học chỉ giới hạn chủ yếu chỉ vào một vấn đề là thông tin di truyền có cơ sở vật lý như thế nào. Việc các nhà vật lý học tham gia giải quyêt các vấn đề sinh học thì không phải điều lạ, vì ngay Mendel xuất thân cũng là nhà vật lý học. Tuy nhiên sự thu hút các nhà vật lý học đến với di truyền học vào những năm 1940 có nguyên nhân đặc biệt. Đúng vào thời điểm này, khi mà giới khoa học ngừng phổ biến ‘sinh lực luận’, nh vật lý học nổi tiếng Niels Bohr, được giải Nobel về thuyết cơ lượng tử (Quantic Mechanics), nêu ra quan điểm rằng một số qua trình sinh học có thể không giải thích trọn vẹn bằng các khái niệm vật lý cổ điển. Sau khi xây dựng thuyết cơ lượng tử, Bohr phát triển các khái niệm tổng quát hơn. Năm 1932, tại hội nghị quốc tế về quang học, Bohr đã phát biểu rằng :”Sự công nhận tầm quan trọng rất lớn của các nguyên tử căn bản trong các chức năng của các sinh vật tự nó không đủ để giải thích một cách toàn diện các hiện tượng sinh học. Vấn đề ở chỗ là làm thế nào khi phân tích các hiện tượng tự nhiên không bỏ sót một số đặc điểm rất quan trọng để hiểu sự sống trên cơ sở thí nghiệm vật lý”. Naêm 1935, Max Delbrück, học trò của Bohr, trong bài báo “Về bản chất các đột biến gen và cấu trúc gen” đã giải thich rằng, chính Di tuyền học là lĩnh vực sinh học, mà trong đó những giải thích từ các quan điểm vật lý và hóa học dường như “không đủ” theo quan niệm mà Bohr nêu ra. Ông chỉ ra rằng “ nếu như trong vật lý các số đo về căn bản dẫn đến đo không gian và thời gian, còn khái niệm căn bản của di truyền học - sự khác nhau trong tính trạng - chẳng lẽ có thể biểu thị trong những đơn vị tuyệt đối”. Theo Delbrück, di truyền học có tính độc lập và gen là phân tử có tính ổn định cao trong một thời gian dài không phụ thuộc tác động của môi trường. Năm 1945, ngay sau thế chiến thứ II một quyển sách nhỏ “Thế nào là sự sống ?” (What is the life ?) đã được xuất bản. Tác giả của sách là E. Schrödinger, một trong những nhà vật lý học nổi tiếng xây dựng thuyết cơ lượng tử. Quyển sách đã thu hút sự chú ý của công chúng, đặc biệt là các nhà vật lý học, vì trong đó Schrödinger cổ vũ cho nghiên cứu sinh học tìm các quy luật vật lý mới. Bắt đầu quyển sách, Schrödinger cho rằng “việc vật lý và hóa học hiện đại chưa có khả năng giải thích các quá trình sống không có nghĩa là không thể giải thích nhờ các khoa học này”. Ông cho rằng chính tính di truyền là chủ đề cần dược giải thích. Điều làm cho Schrödinger ngạc nhiên là làm thế nào các gen nhỏ bé có thể kháng lại những dao động của môi trường diễn ra liên tục mà như hình dạng môi của dòng họ Gabsburg được truyền qua nhiều thế kỷ. Ông cho rằng nhiễm sắc thể là một tinh thể á chu kỳ (aperiodic crystall), mà trên đó có sự sắp xếp các mã di truyền (gnetic code) theo một thứ tự chính xác. Schrödinger cho rằng trong chất sống có “những quy luật vật lý chưa biết đến”. Các quan điểm của Bohr và Schrödinger đã cổ vũ nhiều nhà vật lý học chuyển sang nghiên cứu di truyền học với hoài bảo lãng mạn là tìm ra các quy luật vật lý mới trong bản chất cấu trúc gen. Đến năm 1965, kỷ niệm 100 năm công trình của Mendel, bản chất của gen đã được sáng tỏ, nhưng không tìm ra quy luật vật lý mới, ngoài chuyện đứt và nối các liên kết hydro. Tuy nhiên, có thể nói di truyền học được tiếp thêm một nguồn sinh lực mới đó là các nhà vật lý, hóa học với các công cụ và tư duy chính xác thực hiện thí nghiệm trên những đối tượng VSV có nhiều ưu thế. Họ bắt đầu các nghiên cứu từ những sinh vật đơn giản nhất đó là các phage, vi khuẩn là các sinh vật nhân sơ. M. Delbruck, một nhà vật lý học đã chuyển hoàn toàn sang nghiên cứu sinh học, đã phát biểu rằng lĩnh vực nghiên cứu virus của vi khuẩn là sân chơi tuyệt vời, nơi mà nhiều câu hỏi sâu xa có thể nảy sinh. Thêm vào đó hóa học trên đà phát triển của mình đã cung cấp nhiều phương pháp mơí tinh vi để xác định đánh giá các kết quả thí nghiệm. 2. ƯU THẾ CỦA CÁC ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT Trong nghiên cứu di truyền học, các đối tượng vi sinh vật có nhiều ưu thế hơn hẳn các động vật thực vật bậc cao. 2.1. Thời gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh sản nhanh. Trong điều kiện thuận lợi, tế bào E.coli có thể chia một lần trong 20 phút, còn bacteriophage có thể trong 30 - 40 phút tạo ra hàng trăm cá thể, nấm men có thể chia tế bào trong 2 giờ. Đặc điểm của nghiên cứu di truyền học là theo dõi qua nhiều thế hệ nên các đối tượng vi sinh giúp rút ngắn đáng kể thời gian thí nghiệm. Nếu so thời gian thế hệ của ruồi giấm 2 tuần, của chuột 2 tháng, của người 20 năm thì các vi sinh vật hơn hẳn. Nếu nhà di truyền học phải chờ 2 tuần để có một thế hệ ruồi giấm, thì đối với E.coli, thí nghiệm hôm trước, qua ngày sau đã có thể đánh giá kết quả. 2.2. Tăng vọt số lượng cá thể Các vi sinh vật đơn bào, mỗi tế bào là một cá thể. Nếu đủ dinh dưỡng các vi sinh vật sinh sản nhanh tạo quần thể có số lượng cá thể lớn có thể khoảng 1010 - 1012 tế bào. Tế bào E.coli có đường kính 1 micromet nếu đủ dinh dưỡng trong 44 giờ có thể tạo sinh khối bằng quả đất. Ruồi giấm là đối tượng thuận tiện cho di truyền học quần thể chỉ đạt 105-106 cá thể. Nhờ số lượng lớn cá thể của vi sinh vật, có thể phát hiện các sự kiện di truyền hiếm hoi (như đột biến hay các dạng tái tổ hợp) với tần số 10–8 - 10–11. Như vậy, số lượng cá thể lớn giúp nâng cao năng suất phân giải (resolving power) di truyền tức khả năng phát hiện các đột biến và tái tổ hợp có tần số xuất hiện rất nhỏ. Ưu thế này lại được tăng thêm nhờ môi trường nuôi đơn giản, dễ nuôi cấy, dễ nhân giống, mà điều kiện nuôi cấy không cồng kềnh, ít tốn diện tích hơn so với nuôi ruồi, nuôi chuột và trồng cây. Môi trường nuôi cấy dễ kiểm soát theo công thức chặt chẽ như làm thí nghiệm hóa học. 2.3. Cấu tạo bộ gen đơn giản Vi khuẩn và virus có bộ gen là DNA trần dễ tiến hành thí nghiệm trực tiếp trên DNA cũng như chiết tách tinh sạch. Số locus cũng ít hơn so với sinh vật khác. Các vi nấm và vi tảo có thể tồn tại ở dạng đơn bội (n) với thời gian dài, nên các gen lặn có thể biểu hiện ngay, mà khỏi phải tiến hành lai phân tích hay đưa về dạng đồng hợp tử lặn. Tuy nhiên, các VSV kể trên có trạng thái lưỡng bội (2n) nên cũng dễ dàng thực hiện phân tích tái tổ hợp. Các tính trạng ở vi sinh vật cũng đơn giản hơn, xác định di truyền các tính trạng này ít phức tạp hơn, nên dễ nghiên cứu. Đối với các tính trạng sinh hóa hay tính đề kháng dễ sử dụng môi trường chọn lọc để phát hiện. 2.4. Dễ thu nhận các đột biến Các phân tích di truyền học phần lớn dựa vào những khác biệt của dạng bình thường so với đột biến. Tần số đột biến ở thực vật và động vật trong khoảng 10–5 – 10–7, khó thu nhận và cần thời gian dài vài thế hệ để khẳng định đúng là dạng đột biến. Nhiều đột biến ở động vật dễ gây chết nên số lượng đột biến thu nhận được ở động vật rất hạn chế. Các đột biến ở vi sinh vật có thể thu nhận dễ dàng, thậm chí có tần số xuất hiện thấp 10–10, mà việc xác nhận dạng đột biến cũng rất nhanh. Nhờ ưu thế này mà di truyền học vi sinh vật phát triển rất nhanh hình thành nên di truyền học phân tử và sinh học phân tử. 2.5. Dễ nghiên cứu bằng các kỹ thuật vật lý hóa học Đa số các vi sinh vật có cấu tạo đơn bào nên quần thể của chúng có độ đồng nhất cao hơn so với các tế bào sinh vật đa bào bậc cao bắt nguồn từ nhiều loại mô khác nhau. Cấu tạo tế bào vi sinh vật đơn giản, dễ chiết tách, tinh sạch DNA. Có thể nuôi vi sinh vật đồng nhất (synchronous culture) tức đa số các tế bào ở những giai đoạn phát triển gần giống nhau. Độ đồng nhất cao của vật liệu thí nghiệm tao thuận lợi cho việc sử dụng các phương pháp vật lý hóa học trong nghiên cứu di truyền. Do những ưu điểm kể trên, với việc sử dụng các đối tượng vi sinh vật, di truyền học đã bước vào giai đoạn nghiên cứu di truyền “trong ống nghiệm” (in vitro). Mặc dù các vi sinh vật có những đặc điểm riêng nhưng chúng vẫn tuân theo các quy luật di truyền chung, các kết quả thu được có thể đối chiếu áp dụng cho các vi sinh vật bậc cao. 3. CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA DI TRUYỀN HỌC VI SINH VẬT 3.1. Nghiên cứu trực tiếp ở cấp độ tế bào và phân tử Di truyền học cổ điển sử dụng các đối tượng mô hình như đậu Hà Lan Pisum sativum, cây bắp (ngô) Zea mais, ruồi giấm Drosophila melanogaster và chuột Mus musculus, là những sinh vật đa bào mà sự biểu hiện tính trạng trãi qua một quá trình phát triển phức tạp và kèm theo biệt hóa. Ví dụ, tế bào hồng cầu ở động vật có vú chỉ chuyên sản xuất hemoglobin. Dĩ nhiên mọi biểu hiện sống đều liên quan đến tế bào, nhưng các quan sát ở những đối tượng trên là gián tiếp. Trong khi đó, nhiều đối tượng vi sinh vật như Escherichia coli, nấm men Saccharomyces cerevisiae là sinh vật đơn bào nên các quan sát thực hiện trực tiếp hơn ở mức tế bào. Ví dụ, trên môi trường tối thiểu với lượng muối hữu cơ và glucose cho trước, một tế bào E. coli có thể tổng hợp tất cả các hợp chất cần thiết cho sự tăng trưởng, sống sót và sinh sản. Nếu tế bào bị đột biến mất khả năng tổng hợp một chất nào đó như một loại amino acid thì nó không mọc được trên môi trường tối thiểu. Trên môi trường có bổ sung thuốc kháng sinh chỉ tế bào đề kháng mọc được. Hơn thế nữa, các tế bào vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản dễ kiểm soát thành phần môi trường nuôi, dễ nuôi cấy, dễ nhân giống, dễ dàng thu nhận nhiều loại đột biến phục vụ cho nghiên cứu trực tiếp và nhanh chóng ở cấp độ tế bào và phân tử. Do vậy, chúng là những đối tượng lý tưởng cho nghiên cứu di truyền phân tử. 3.2. Dòng tế bào Đặc điểm của các tế bào vi sinh vật là rất nhỏ bé, phải nhìn dưới kính hiển vi mới thấy được. Do vậy khó có thể quan sát từng tế bào riêng lẽ, hơn nữa bằng cách này cũng không ghi nhận được các tính trạng biến dưỡng, tính đề kháng và nhiều tính trạng khác. Do vậy, di truyền vi sinh vật không nghiên cứu từng tế bào riêng lẻ mà là dòng của tế bào, tức tập hợp của nhiều tế bào bắt nguồn từ một tế bào ban đầu nhờ sinh sản vô tính. Thường, tế bào vi sinh vật được cấy lên môi trường thạch đặc, rồi chà trãi đều để các tế bào nằm rời ra thì mỗi tế bào mọc lên thành một cụm rời gọi là khuẩn lạc (colony) Hình 1.1. Mỗi khuẩn lạc cũng là một dòng tế bào (clone) gồm các tế bào bắt nguồn tự sự phân chia của một tế bào ban đầu. Mỗi khuẩn lạc dễ nhìn thấy bằng mắt thường có tối thiểu 107 (mười triệu) tế bào. Như vậy, các tính trạng ở vi sinh vật được ghi nhận qua một quần thể gồm hàng trăm triệu, hàng tỉ tế bào.Dòng tế bào mang một đặc tính di truyền nào đó gọi là chủng (strain). Ví dụ : chủng vi khuẩn tạo nhiều vitamin B12 hay chủng vi khuẩn mất khả năng tổng hợp một amino acid nào đó. Hình 1.1a. Khuẩn lạc vi khuẩn Hình 1.1b. Khuẩn lạc nấm men 3.3. Các tính trạng Các đột biến ở vi sinh vật thường được phát hiện theo sự biến đổi các tính trạng sau : a. Hình thái: kích thước, hình dạng tế bào hay khuẩn lạc, có màng nhân hay không, khả năng di động... b. Sinh hóa: sự hiện diện của các sắc tố, màu sắc đặc trưng. c. Nuôi cấy: như kiểu hô hấp, kiểu dinh dưỡng (khuyết dưỡng - auxotroph) hoặc nhu cầu đòi hỏi các nhân tố tăng trưởng. d. Tính đề kháng: như kháng thuốc, kháng phage, chịu nhiệt... e. Miễn dịch : như các phản ứng kháng thể, kháng nguyên... Các đột biến có thể xuất hiện ngẫu nhiên hay do gây tạo ra nhờ các tác nhân gây đột biến. Mỗi gen có tần số đột biến đặc trưng. Các tính trạng ở vi sinh vật được kí hiệu bằng 3 chữ tắt tiếng Anh hoặc đôi khi chữ hoa đầu tiên. Kèm theo kí hiệu còn thêm dấu + hoặc – hoặc chữ tắt để giải thích rõ thêm tính trạng. Ví dụ : lac– để chỉ mất khả năng tổng hợp lactose; his+ - tổng hợp histidine; strS – nhạy cảm (Sensible) với Streptomycin, strR – đề kháng (Resistant) Streptomycin. Để chỉ hai giới tính khác nhau không dùng hai kí hiệu ♀ và ♂ thay vào đó là các chữ như mt (+), mt (-) (mating type) (ở Chlamydomonas reinhardi), hoặc A, a (ở Neurospora crassa) hay a và a (nấm men). 3.4. Cấu trúc bộ gen DNA hiện diện trong bộ gen (Genome) của tất cả các loại tế bào từ vi khuẩn đến người. Giữa các sinh vật nhân sơ Prokaryotae và nhân chuẩn Eukaryotae có sự khác nhau đáng kể về kích thước, thành phần cấu tạo và tổ chức của DNA trong tế bào. Bộ gen của vi khuẩn E. coli và đa số các sinh vật nhân sơ là một phân tử DNA có dạng vòng tròn kín. Khái niệm nhiễm sắc thể hiện nay được dùng cho cả vi khuẩn, nên nói nhiễm sắc thể vi khuẩn ta hiểu đó là s