Luận văn Nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể của một số loài trong chi Ráy (Alocasia) và chi Khoai môn (Colocasia)

Mở đầu Nhiễm sắc thể là cơ sở vật chất di truyền ở cấp độ tế bào. Các quá trình nguyên phân, giảm phân và thụ tinh chính là cơ chế di truyền ở cấp độ tế bào. nếu các rối loạn xảy ra trong quá trình phân bào (nguyên phân, giảm phân) sẽ dẫn đến hiện tượng bộ NST được nhân đôi nhưng không phân ly và không tạo nên các tế bào con mà tạo nên các tế bào đa bội hoặc các thể nhiễm sắc phân ly không đồng đều tạo nên các tế bào lệch bội. Trong thực tiễn sản xuất, ứng dụng hiện tượng đột biến số lượng NST người ta đã tạo ra được các loại cây trồng có kích thước và sức sống cao hơn các cây lưỡng bội (2n). Ngô tứ bội (4n) khoẻ hơn hẳn ngô lưỡng bội (2n) và hàm lượng vitamin tăng thêm 20%. Dưa hấu tứ bội có 44 nhiễm sắc thể, quả to cũng được đưa vào sản xuất. Dưa hấu tam bội được xem như không hạt. Ngoài ra còn củ cải đường tam bội, tứ bội Trong tự nhiên hiện tượng đột biến số lượng NST cũng xảy ra khá phổ biến, khoảng một nửa số lượng các chi thực vật mang bộ NST dạng đa bội [10]. Chuối, dứa tam bội được trồng rộng rãi trong sản xuất. Chi Cúc có rất nhiều dạng bội NST 2n=18, 36, 54, 72 và 90. Trong chi Solanum gồm khoai tây, cà, ớt có bộ NST 2n= 24, 36, 48[17] Theo nhiều nghiên cứu thì họ Ráy xuất hiện khá nhiều dạng bội NST, trong đó chi Ráy có cả 3 dạng bội là lưỡng bội (2n=28), tam bội (2n=3x=42) và tứ bội (2n=4x=56). Chi Khoai môn đã phát hiện ra 2 dạng bội là lưỡng bội (2n=2x=28) và tam bội (2n=3x=42). Mặt khác cũng theo nhiều nghiên cứu thấy rằng bộ NST của một số loài trong chi Ráy có kích thước lớn hơn so với nhiều loài thực vật khác, chúng có thể quan sát được dưới kính hiển vi thông thường. ở Việt Nam các cây họ Ráy chiếm tỉ lệ tương đối lớn về thành phần loài và khu vực phân bố. Hiện đã có một số công trình nghiên cứu về bộ NST của một số loài trong họ Ráy nhưng số lượng chưa nhiều và chưa thể cung cấp tiêu bản đột biến NST cho các trường phổ thông để minh hoạ cho các bài giảng Sinh học, mà phần lớn các tiêu bản NST phải nhập từ nước ngoài với giá khá đắt, đặc biệt tiêu bản về đột biến NST thì hầu như không có. Do đó, để góp phần minh họa sinh động cho các bài giảng Sinh học ở phổ thông, để các em học sinh có thể quan sát bộ NST (đặc biệt bộ NST đa bội) của loài trên kính hiển vi thông thường tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể của một số loài trong chi Ráy (Alocasia) và chi Khoai môn (Colocasia)”. Đề tài được tiến hành nhằm mục đích: - Điều tra và thu thập một số loài trong họ Ráy (đặc biệt dạng đa bội) ở một số địa phương có điều kiện thu mẫu. - Làm các mẫu tiêu bản cố định, quan sát và đếm số lượng nhiễm sắc thể dưới kính hiển vi. - Phân tích hình thái NST và công thức kiểu nhân của một số loài trong chi Ráy (Alocasia) và chi Khoai môn (Colocasia). Chương 1. Tổng quan tài liệu 1.1. Lịch sử nghiên cứu nhiễm sắc thể Năm 1665 Robert Hook (1635-1703) nhà nghiên cứu người Anh lần đầu tiên đã phát hiện ra tế bào nhờ sử dụng kính hiển vi với độ phóng đại 30 lần và đã xuất bản cuốn “Vi ảnh” trong đó ông mô tả cấu trúc hiển vi của mô bần thực vật dưới dạng những ống rỗng và đã đặt tên cho chúng là tế bào [10]. Jan Svammerdam (1637-1680) là nhà vi phẫu thuật xuất sắc người Hà Lan đã nghiên cứu cấu trúc hiển vi của côn trùng và đã quan sát thấy các tế bào máu đỏ trong dòng máu của động vật có xương sống [10]. Nhà thực vật học người Anh Nemia Grew (1641-1712) đã nghiên cứu cấu trúc hiển vi của thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản và đã mô tả tỉ mỉ các hạt phấn [10]. Nhà sinh lí học người Sec là B. Purkinje (1787-1869) và nhà thực vật học người Đức Hugo Fon Mol (1805-1872) phát hiện ra rằng tế bào không phải là xoang rỗng như R. Hook quan niệm mà là khối nguyên sinh chất có chứa các chất phức tạp [10]. Năm 1838, nhà thực vật học người Đức là Jascob Schleiden (1804-1881) đã đề xuất quan điểm cho rằng tất cả thực vật đều được cấu tạo từ tế bào và tế bào là “đơn vị cấu trúc sống” cơ sở. Tiếp theo, năm 1839 nhà sinh lí học người Đức Teodor Schwann (1810-1882) đã mở rộng và bổ sung cho luận điểm của Schleiden. Ông đã đưa ra một kết luận tổng quát là thực vật và động vật đều có qui luật chung nhất là đều có cấu tạo tế bào. Như vậy, Schleiden và Schwann đã đề xuất học thuyết tế bào và khai sinh ra tế bào học [10]. Năm 1831 nhà thực vật học Xcôtlan Robert Brawn (1773-1852) lần đầu tiên phát hiện ra nhân tế bào và phát biểu “Nhân tế bào là thể tất yếu đối với từng tế bào” và 7 năm sau Schleiden trong học thuyết tế bào chứng minh rằng nhân đóng vai trò rất quan trọng trong sự sinh sản [1]. Năm 1856 Mirchow đã từng đề xuất “tế bào chỉ được sinh ra từ tế bào có trước” [10]. Năm 1869 lần đầu tiên nhà sinh vật học người Thụy Sỹ F. Misher đã phát hiện ra axit nucleic trong nhân tế bào. Mãi đến những năm cuối 80 của thế kỉ XIX nhờ công trình nghiên cứu của A. Chneider người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng phân bào vào năm 1873. Về sau, Valter Flemming (1843-1905) bằng phương pháp định hình và nhuộm màu tế bào động vật ông đã phát hiện ra những hạt rất nhỏ bé bắt màu, phân bố rải rác trong nhân tế bào và đặt tên là hạt nhiễm sắc. Khi nghiên cứu mô thực vật đang sinh trưởng, ông đã quan sát đựơc các giai đoạn của sự phân bào và sự hình thành các thể hình sợi nhuộm màu mà về sau W. Waldeyer gọi là thể nhiễm sắc vào năm 1888. Quá trình phân bào có sợi được Flemming gọi là phân bào có tơ. Năm 1882 ông đã công bố các nghiên cứu về quá trình phân bào và tập tính của thể nhiễm sắc qua phân bào. Trong quá trình phân bào mỗi thể nhiễm sắc gồm hai sợi, về sau tách khỏi nhau và phân về hai tế bào con. [1, 6, 10] Năm 1875, O. Hertwig đã kết luận ở thực vật cũng như động vật quá trình thụ tinh là sự kết hợp của giao tử bố và mẹ. Năm 1887, nhà tế bào học người Bỉ Eduard Van Beneden (1846-1910) quan sát thấy trong tế bào các thể nhiễm sắc tồn tại thành từng cặp được gọi là cặp tương đồng (2n) và các sinh vật khác nhau có số lượng thể nhiễm sắc khác nhau và là cố định cho loài. Hơn nữa ông cũng quan sát thấy khi tạo thành giao tử (tinh trùng và trứng) số thể nhiễm sắc giảm đi một nửa, quá trình phân bào này gọi là phân bào giảm số (về sau được gọi là giảm phân). [1] Năm 1884, E. Strasburger mô tả quá trình thụ tinh ở cây có hạt và năm 1894, ông đã kết luận là ở tất cả sinh vật có giới tính qua giảm phân số lượng thể nhiễm sắc đều bị giảm đi một nửa [10]. T. Boveri (1892) mô tả quá trình giảm phân ở giun tròn Acaris. Trong quá trình thụ tinh, khi tinh trùng kết hợp với trứng thì các thể nhiễm sắc lại được tổ hợp lại thành cặp tương đồng. [1, 10] Sau năm 1900, khi các qui luật Menden được tái phát hiện, người ta bắt đầu chú ý tới các nhân tố di truyền mà một số nhà khoa học hồi ấy cho rằng phải nằm trên nhiễm sắc thể [6]. Năm 1902, nhà tế bào học Walter Sutton (1876-1916) đã giải thích các qui luật Mendel bằng tập tính của thể nhiễm sắc qua giảm phân và thụ tinh [10]. Người có công lớn trong việc xác định điều này là nhà di truyền học Mĩ Thomas Hunt Morgan (1866-1945), ông đã chứng minh được rằng các gen sắp xếp thành hàng trên nhiễm sắc thể. Các gen phân bố trên nhiễm sắc thể tại những vị trí xác định gọi là alen. Các alen của một gen chiếm cùng vị trí trên các nhiễm sắc thể tương đồng. Lôcut là vị trí của gen trên nhiễm sắc thể. Gen được gọi là đồng hợp tử nếu hai lôcut có những alen giống nhau và dị hợp tử khi các alen đó khác nhau. Vì trong tế bào số lượng gen lớn hơn số lượng nhiễm sắc thể rất nhiều nên mỗi nhiễm sắc thể phải mang nhiều gen. Các gen nằm trên cùng một nhiễm sắc thể thì phân li cùng nhau trong quá trình phân bào và làm thành nhóm liên kết. Số nhóm liên kết của một loài sinh vật bằng số nhiễm sắc thể đơn bội của loài này. Với các cống hiến xuất sắc cho Di truyền học, năm 1933 Morgan đã được tặng giải thưởng Nobel. [6] *Đột biến nhiễm sắc thể: Năm 1791, tại một trang trại ở Dover bang Massachusetts, Seth Wrigth một nhà chăn nuôi cừu đã quan sát thấy trong đàn cừu của mình xuất hiện một con cừu đực đặc biệt lùn, chân ngắn. Ông đã cho con cừu đực này lai với 15 con cừu cái và đã thu được hai con lùn, chân ngắn và khi cho các con lùn, chân ngắn lai với nhau ông thu được dòng cừu lùn, chân ngắn. Năm 1900, nhà thực vật học người Hà Lan Hugo de Vries (1848-1935) một trong ba nhà khoa học tái phát hiện ra qui luật Mendel, khi nghiên cứu trên thực vật đã quan sát thấy những biến đổi mà ông cho là đột biến. Sau này các nhà di truyền học phát hiện ra đột biến mà Vries quan sát thấy ở cây Oenothera thực ra không phải là đột biến gen mà là đột biến thể nhiễm sắc. Trong những năm 30 và 40 nhờ hoàn thiện kĩ thuật hiển vi và kĩ thuật nhuộm màu các nhà di truyền tế bào đã thành lập được kiểu nhân của nhiều loài thực vật và động vật kể cả con người và đã phát hiện ra các đột biến thể nhiễm sắc về cấu trúc và số lượng. Đột biến thể nhiễm sắc về cấu trúc và số lượng là nguyên liệu của chọn lọc tự nhiên. Đột biến đa bội thể là hướng tiến hoá của thực vật. Ngày nay người ta đã đánh giá có gần 1/2 số loài thực vật là đa bội. Lý thuyết về đột biến không chỉ có tác dụng thúc đẩy nghiên cứu bản chất của gen và của hiện tượng di truyền mà còn đóng góp cho các nghiên cứu về cơ chế tiến hoá thời hậu Darwin. Các nhà di truyền học đã đi đến kết luận quan trọng: đột biến là nguyên liệu của chọn lọc tự nhiên và của tiến hoá. Đột biến không mang tính định hướng và chỉ mang tính định hướng khi được chọn lọc bởi nhân tố của điều kiện môi trường. [10] 1.2. Đại cương về nhiễm sắc thể và đột biến nhiễm sắc thể 1.2.1. Đại cương về nhiễm sắc thể 1.2.1.1. Hình dạng, kích thước và số lượng nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể là những cấu trúc nằm trong nhân tế bào có khả năng bắt màu đặc trưng bằng thuốc nhuộm kiềm tính và có thể quan sát dưới kính hiển vi thường. Hình thái nhiễm sắc thể nhìn rõ nhất ở kì giữa và những giai đoạn sớm của kì sau nguyên phân khi mà NST đã rút ngắn và phân bố trên mặt phẳng xích đạo. ở kì giữa của quá trình nguyên phân, NST có hình dạng và kích thước đặc trưng, thường hình chấm hoặc hình que, có kích thước khoảng 0,2- 3mm đường kính và 0,2- 50 mm chiều dài [9]. Cấu trúc của một NST bao gồm : tâm động và các vai. Tâm động là thành phần không thể thiếu được của mỗi NST. Nó là trung tâm vận động, là điểm trượt của các chromatit về các cực của tế bào ở kì sau của quá trình phân bào. Đó là điểm thắt eo chia NST thành hai vai với chiều dài khác nhau. Dựa vào vị trí tâm động có thể phân biệt hình thái NST thành NST tâm cân khi tâm động nằm ở vùng giữa, tâm lệch giữa khi tâm động nằm ở vùng gần giữa, tâm lệch mút khi tâm động nằm gần vùng tận và tâm mút khi tâm động nằm ở vùng tận. Ngoài ra một số NST còn có eo thứ cấp và thể kèm. Mỗi loài sinh vật có số lượng NST là cố định và đặc trưng cho loài đó, ví dụ: người (Homo sapiens) 2n=46, ruồi giấm (Drosophila melanogaster) 2n=8 ở các tế bào sinh dưỡng (soma) bộ NST tồn tại thành từng cặp gọi là cặp NST tương đồng (trong đó một chiếc có nguồn gốc từ bố và một chiếc có nguồn gốc từ mẹ). Tập hợp tất cả các NST trong tế bào sinh dưỡng của loài được gọi là bộ NST lưỡng bội của loài (2n). Trong các tế bào và cơ thể đơn bội, các tế bào giao tử thì bộ NST có số lượng chỉ bằng một nửa số NST trong tế bào lưỡng bội của loài, được gọi là bộ NST đơn bội (n). Ngoài ra có bộ đa bội đặc trưng cho tế bào và cơ thể đa bội, số NST tăng lên theo bội số của n. Cấu trúc hiển vi và siêu hiển vi của nhiễm sắc thể ở các tế bào vi khuẩn và vi rút, NST có cấu tạo đơn giản chỉ là những phân tử ADN trần, chuỗi kép, mạch vòng hoặc chỉ là phân tử ADN trần, mạch kép. ở các tế bào sinh vật nhân chuẩn, NST có cấu trúc phức tạp bao gồm ADN liên kết với các phân tử protein, trong đó phân tử ADN được “đóng gói” theo các mức độ nhất định phù hợp với việc sao chép, phiên mã cũng như phân ly của các NST trong quá trình phân chia tế bào. Sợi NST có kích thước 10 nm được cấu tạo từ ADN và protein dạng histon H1, H2A, H2B, H3, H4 và protein axit tạo nên các nucleosome. Mỗi nucleosome do phân tử ADN cuộn xoắn 1,75 vòng quanh 8 phân tử histon, mỗi vòng xoắn ADN gồm 80 cặp nucleotit. Các nucleosome liên kết gấp khúc nhờ histon H1 để tạo thành sợi nhiễm sắc có kích thước 30 nm quan sát thấy dưới kính hiển vi điện tử trong kì trung gian. Các sợi nhiễm sắc xoắn gấp khúc khi đạt cực đại tạo thành các chromatit có đường kính 700 nm. Một NST điển hình bao gồm hai chromatit có đường kính khoảng 1400- 500 nm . Một số loài có NST rất lớn, đường kính có thể tới 6000 nm. (Hình 1). Hình 1: Cấu trúc nhiễm sắc thể 1.2.2. Đột biến nhiễm sắc thể Đột biến NST bao gồm đột biến cấu trúc và đột biến số lượng NST. Đột biến cấu trúc NST thể hiện ở các dạng: mất đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn và chuyển đoạn đều có thể quan sát thấy ở tế bào soma trong quá trình phát triển và biệt hoá chúng. Đột biến số lượng NST của các tế bào soma xảy ra trong các tế bào, mô hoặc cơ quan khác nhau hoặc ở toàn bộ cơ thể dưới ảnh hưởng của các tác nhân gây đột biến khác nhau như phóng xạ, hoá chất. Đột biến số lượng NST có thể gây nên do sai lệch trong quá trình nguyên phân khi bộ NST đã được nhân đôi qua giai đoạn S nhưng không phân ly và không tạo nên các tế bào con, mà tạo nên tế bào đa bội (được gọi là tự đa bội), hoặc các NST phân ly không đồng đều tạo nên các tế bào lệch bội. Trong quá trình giảm phân và thụ tinh cũng có thể dẫn tới hiện tượng đa bội và lệch bội ở các tế bào soma. Hiện tượng tự đa bội quan sát thấy rất nhiều ở mô và cơ quan của thực vật thường được gọi là hiện tượng “khảm” và cơ thể đó được gọi là “cơ thể khảm”. Hiện tượng đa bội xuất hiện trong cơ thể khảm thường được gọi là đa bội mitos để phân biệt với đa bội meios do sự giảm phân và thụ tinh tạo nên. Hiện tượng đa bội meios là rất phổ biến và là một hướng tiến hoá trong thế giới thực vật được các nhà di truyền tế bào nghiên cứu kỹ và ứng dụng vào công tác lai tạo giống mới có năng suất cao. Còn hiện tượng đa bội mitos được tạo nên trong các tế bào soma trong đời sống cá thể tuy quan sát thấy ở thực vật và động vật nhưng hiếm hơn. Người ta có thể gây đa bội thực nghiệm bằng cách chiếu xạ hoặc hoá chất. Sử dụng chất colchicine các nhà tạo giống đã tạo nên các dòng thực vật đa bội cho năng suất cao như dâu tằm, mía Đột biến lệch bội là trường hợp bộ NST có số lượng sai lệch so với bộ chuẩn 2n, ví dụ: 2n+1, 2n-1 Đột biến lệch bội do sự không phân ly của các cặp NST tương đồng qua meios dẫn đến khi thụ tinh tạo hợp tử bị lệch bội về một cặp NST nào đó, ví dụ bệnh Đao có 3 NST 21 Đối với tế bào soma khi phân bào mitos cũng quan sát thấy sự phân ly sai lệch trong kỳ sau dẫn đến hiện tượng lệch bội. Trong nuôi cấy in vitro dưới tác dụng của nhiều nhân tố như môi trường dinh dưỡng, hoá chất, chiếu xạ đối với tế bào thực vật cũng như động vật đều quan sát thấy hiện tượng lệch bội trong bộ NST. Tình hình nghiên cứu chi Ráy (Alocasia) và chi Khoai môn (Colocasia) trên thế giới Họ Ráy (Araceae) được mô tả lần đầu tiên vào năm 1789 bởi nhà thực vật người Pháp A. de Jussieu. Nhưng mãi đến năm 1860, H. Schott, người áo mới chính thức đưa ra hệ thống phân loại học các cây họ Ráy và ông được xem là người đặt nền móng đầu tiên cho phân loại họ Ráy. [32] Năm 1920, Engler đã đưa ra một hệ thống phân loại khác được coi là ít nhân tạo hơn. Ông không chỉ dựa trên cấu trúc bông mo mà trên cả các hình thái giải phẫu của cơ quan sinh dưỡng. [27] Năm 1970, Hotta đã đưa ra một hệ thống phân loại họ Ráy ở vùng Đông Nam á và Malaysia dựa trên các đặc điểm hình thái hoa, cơ quan sinh dưỡng và sinh thái học [29]. Grayum (1987) dựa trên nhiều số liệu nghiên cứu mới về tế bào học, sinh thái học, giải phẫu hình thái đã xây dựng một hệ thống phân loại họ Ráy có khác chút ít so với các hệ thống phân loại trước đây [25]. Ngoài ra còn nhiều hệ thống phân loại khác như hệ thống phân loại của Bogner (Đức) và Nicolson (1991), Boyce (1995) [8] Theo Willis (1966) chi Ráy (Alocasia) có khoảng 60-70 loài phân bố rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới. Nguồn gốc của hầu hết các loài Alocasia vẫn chưa biết chính xác nhưng quan sát thấy nhiều ở ấn Độ đến Sirilanca, khắp Đông Nam Châu á và Thái Bình Dương. [8] Phân tích di truyền tế bào cây họ Ráy nói chung và các loài trong chi Alocasia và chi Colocasia nói riêng đã được tiến hành khá nhiều. Tính đến những năm đầu thập kỉ 90 của thế kỉ 20 đã có 700 loài được quan sát số lượng NST. [8] Số lượng NST cơ bản được Vignolus (1939) báo cáo đối với chi Ráy (Alocasia) là n=13. Tuy nhiên các công trình nghiên cứu gần đây đã thống nhất rằng số lượng NST cơ bản ở chi Alocasia là n=14. [31, 32] Năm 1974, Bhattacharya đã báo cáo số lượng NST của 15 loài trong chi Alocasia G. Don. Sự đa hình về mức bội NST cũng đã được phát hiện là 2n=28, 42 và 56 [26]. Số lượng NST cơ bản đối với chi Colocasia được báo cáo là n=14. Hai dạng bội NST đã được phát hiện là dạng lưỡng bội (2n=2x=28) và dạng tam bội (2n=3x=42). Cả hai dạng Khoai môn này đều trồng nhiều nơi trên thế giới và đóng nguồn gốc các giống Khoai môn-sọ tam bội vẫn luôn được quan tâm nghiên cứu nhưng mối quan hệ giữa hai dạng bộ NST ở loài nay vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu kết hợp đặc điểm hình thái, nông học với các nghiên cứu di truyền tế bào và di truyền phân tử đã và đang được tiến hành giúp cho công tác nghiên cứu phân loại ở mức dưới loài và các loài trong chi ngày càng chính xác hơn, mở ra những nhận thức mới về nghiên cứu tiến hoá và mở rộng tiến hoá ở các loài trong chi Khoai môn (Colocasia) nói riêng và họ Ráy (Araceae) nói chung. Tình hình nghiên cứu chi Ráy (Alocasia) và chi Khoai môn (Colocasia) ở Việt Nam Các cây họ Ráy ở Việt Nam lần đầu tiên được nghiên cứu và mô rả trong công trình nghiên cứu của nhà tự nhiên học Bồ Đào Nha J. Loureiro. Trong công trình nghiên cứu của mình, ông đã miêu tả 13 loài và 1 chi mới cho khoa học là chi Lasia. Mãi gần 100 năm sau, năm 1882, họ Ráy ở Việt Nam mới lại được biết tới qua công bố của Brown về chi mới cho khoa học, chi Pseudodracontium. Những năm sau đó, các loài Ráy ở Việt Nam cũng được nghiên cứu bởi Engler và Krause. Các ông đã công bố tổng số 20 loài mới cho khoa học từ Việt Nam. [27, 30] Người có công lớn nhất trong nghiên cứu họ Ráy ở Việt nam là nhà thực vật học Pháp F. Gagnepain. Ông cũng là người đầu tiên nghiên cứu họ Ráy ở Đông Dương một cách có hệ thống. Trong cuốn “Thực vật chí Đại cương Đông Dương”, năm 1942, ông đã liệt kê 21 chi và 80 loài Ráy có ở Việt Nam. [8] Công trình nghiên cứu tiếp theo về họ Ráy ở Việt Nam là của giáo sư Phạm Hoàng Hộ. Trong cuốn “Cây cỏ miền Nam Việt Nam” xuất bản năm 1972, ông đã mô tả 60 loài Ráy ở miền Nam [10]. Sau đó, năm 1993 ông đã biên soạn lại họ Ráy trong cuốn “Cây cỏ Việt Nam - quyển III”. Trong công trình này ông đã mô tả 94 loài thuộc 23 chi Ráy ở dạng trồng và dạng hoang dại. [13] Theo Phạm Hoàng Hộ (1993), chi Ráy (Alocasia) có 8 loài, trong đó có 2 loài được mô tả là A. macrorrhiza và A. odora C. Koch. Theo mô tả của ông, loài A. odora C. Koch có tên gọi là Mùng thơm hay Bạc hà có đặc điểm: lá xanh tươi, phấn trăng trắng, phiến hình lọng, tai tròn, trồng lấy lá và cuống lá để nấu ăn [12, 13]. Tương tự, 2 loài trong chi Khoai môn được mô tả là C. esculenta (cây Môn nước) và C. gigantea (Khoai môn to). Tuy nhiên các mô tả của Phạm Hoàng Hộ đối với loài C. gigantea cũng chưa phù hợp với thực tế. Gần đây, Nguyễn Xuân Viết đã có những mô tả bổ sung và định rõ tên khoa học của loài Dọc mùng hay Mùng thơm là C. gigantea [Tạp chí Khoa học tự nhiên, Trường ĐHSP Hà Nội. Số 1-2003]. Trong cuốn sách nhiều tác giả: “Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam” do Lê Khả Kế chủ biên, đã mô tả 18 chi và 40 loài Ráy phổ biến ở Việt Nam, đồng thời cũng nêu lên công dụng của một số loài và nơi sống của chúng [16]. Nhìn chung các loài trong hai chi Alocasia và Colocasia do Lê Khả Kế mô tả là khác nhiều so với mô tả của Phạm Hoàng Hộ (1993). Ngoài ra các cây họ Ráy còn được đề cập trong các công trình ngiên cứu của Nguyễn Bá (1974) [2], Đỗ Tất Lợi (1995) [20], Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến (1978) [4] Mới đây nhất, tại Hội nghị “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống” đã có rất nhiều báo cáo về các công trình nghiên cứu trên đối tượng chi Ráy. Nguyễn Văn Dư và Nguyễn Xuân Viết đã công bố bổ sung một loài mới Colocasia lihengae được phát hiện tại vườn Quốc gia Ba Vì - Hà Tây cho hệ thực vật Việt Nam. Qua phân tích hình thái học và điện di izozym, các tác giả đã phán đoán rằng đây có thể là một loài lai tự nhiên. [7] Nguyễn Xuân Viết cũng đã nghiên cứu bộ NST và đặc điểm kiểu nhân của loài Ráy A. odora C. Koch ở Việt Nam. Trong công trình nghiên cứu của mình, ông đã quan sát thấy tất cả các dạng bội NST (2n=28, 42 và 56) được báo cáo ở loài A. odora của các tác giả trên thế giới đều đã được phát hiện trong các cây Ráy A. odora ở Việt Nam. Ông cũng đã phân tích mối quan hệ giữa các dạng bội NST này. [22] Các loài Khoai môn Việt Nam cũng được Nguyễn Xuân Viết và Nguyễn Thị Hạnh mô tả trong bài báo “Số lượng thể nhiễm sắc và kiểu nhân (karyotype) của các loài Colocasia ở miền Bắc Việt Nam”. Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về kiểu nhân của các loài C. ssp. nói chung và C. esculenta nói riêng. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra 2 dạng bội NST của 3 loài là 2n=2x=28 và 2n=3x=42. [24] Đặc biệt trong báo cáo “Nghiên cứu kiểu nhân, đa dạng kiểu nhân và đa hình izozym các loài trong chi Khoai môn sọ (Colocasia) và chi Ráy (Alocasia) ở miền Bắc Việt Nam”, Nguyễn Xuân Viết đã mô tả một cách tổng hợp kiểu nhân và phân tích izozym các loài trong chi Ráy Alocasia và chi Khoai môn Colocasia ở Việt Nam. Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu về chi Ráy và chi Khoai môn ở Việt Nam. Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Nguyễn Hữu Nghĩa, Vũ Linh Chi trong công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền nguồn gen Khoai môn - sọ theo vùng địa lí sinh thái, dựa theo chỉ số Shannon-Weaver (H’) và các bản đồ theo GIS đã thấy được sự biến động khá rõ nét về sự đa dạng di truyền các giống Khoai môn sọ tại các vùng địa lí sinh thái về các đặc điểm sinh thái nông học. [14] Hiện nay, Viện sinh thái và Tài nguyên Sinh vật Việt Nam cũng đang nghiên cứu và phân loại các cây họ Ráy ở miền Bắc Việt Nam. Theo kết quả điều tra thì họ Ráy ở Việt Nam có 23 chi và 120 loài trong đó chi Ráy (Alocasia) có khoảng 10 loài và chi Khoai môn (Colocasia) có 3 loài. [8] Mặc dù đã có một số nghiên cứu về sự đa dạng di truyền các giống Khoai môn sọ và Ráy ở nước ta nhưng những nghiên cứu này mới chỉ là bước đầu. Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tổng cộng có 42 mẫu cây thuộc 2 chi Ráy (Alocasia) và chi Khoai môn (Colocasia). Trong đó chi Ráy có 2 loài: Alocasia indica (8 mẫu cây) và Alocasia odora (11 mẫu cây). Chi Khoai môn có 1 loài là Colocasia esculenta (23 mẫu cây). Các mẫu cây được thu thập tại một số địa phương như: Hà Đông (Hà Tây), Ao Vua (Hà Tây) và Ninh Bình. Sau đó được trồng tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền- Khoa Sinh học - ĐH KHTN - ĐHQGHN để phân tích bộ nhiễm sắc thể ở kì giữa của các tế bào đỉnh sinh trưởng của rễ. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp mô tả hình thái Hình thái được mô tả theo hướng dẫn mô tả của Phạm Hoàng Hộ, kết hợp với các tài liệu mô tả của các tác giả trước đó. Định tên loài cho các mẫy cây thu thập được dựa trên các đặc điểm hình thái thực vật học cùng với tra cứu tài liệu chuyên khảo của Engker (1920), Hotta (1970)và có tham khảo mô tả của Phạm Hoàng Hộ. Phương pháp nghiên cứu nhiễm sắc thể 2.2.2.1. Xử lí mẫu rễ Các mẫu cây sau khi thu thập về được cắt bỏ hết rễ, lá và trồng trong cát ẩm. Khi rễ dài khoảng 1-2 cm thì có thể tiến hành thu rễ. Các mẫu rễ được lấy vào các thời điểm khác nhau trong ngày và các ngày khác nhau. Trên cơ sở đó chúng tôi đã xác định được thời điểm lấy mẫu thích hợp là vào buổi sáng từ 7-8 giờ khi nhiệt độ từ 20-300 C. Sau khi thu rễ thì xử lí bằng cách ngâm rễ trong dung dịch colchicine 0,02% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiếp đó rửa rễ bằng nước cất và chuyển sang dung dịch nhược trương Natri citrat 0,45% trong thời gian 15-30 phút. Cố định rễ Rễ lấy ra khỏi dung dịch Natri citrat 0,45% được rửa nhanh bằng nước cất và thấm khô, sau đó đưa vào dung dịch cố định Carnua cải tiến (3 cồn: 1 axit acetic). Thời gian cố định từ 6-12 giờ. 2.2.2.3. Rửa mẫu vật Hết thời gian cố định mẫu vật, rễ được rửa bằng cồn 700 khoảng 2-3 lần cho đến khi hết mùi axit acetic. Sau đó giữ trong cồn 700 và để trong ngăn mát tủ lạnh. Mẫu có thể giữ được rất lâu để phân tích. . Làm tiêu bản nhiễm sắc thể Tiêu bản nhiễm sắc thể được làm theo phương pháp ép. Các mẫu rễ được lấy ra, rửa sạch trong nước cất, sau đó được đun cách thuỷ trong thuốc nhuộm Carmin acetic 45% với thời gian 15-30 phút. Dùng dao lam cắt phần chóp rễ bắt màu đậm đưa lên lam kính, nhỏ một giọt Carmin acetic, đậy lamen và gõ nhẹ lên lamen cho các tế bào dàn đều và tách nhau ra. Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi quang học thông thường ở vật kính 40 để phát hiện các mẫu tiêu bản đẹp, có nhiều tế bào với các nhiễm sắc thể phân chia ở kì giữa có thể phân biệt nhau được chuyển sang tiêu bản cố định. Chuyển tiêu bản tạm thời sang tiêu bản cố định Chọn tiêu bản đẹp cho vào cốc đựng cồn tuyệt đối để tách lamen. Sau đó