Đồ án Vi nhân giống lan hài (paphiopedilum)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC –— SEMINAR VI NHÂN GIỐNG LAN HÀI (PAPHIOPEDILUM) GVHD: KS. BÙI THẾ VINH NHÓM SVTH: 1. NGUYỄN THỊ KIM HẢI 2. PHAN THỊ LỆ CHI 3. TRẦN THU TRANG 4. VŨ THỊ MỸ LINH 5. VÕ THỊ TRUYỀN 6. NGUYỄN PHƯƠNG HÀ (A) -2008- I. TỔNG QUAN VỀ LAN HÀI Vài nét về Lan Hài I.1 Phân loại Cây lan Paphiopedilum là loài lan thuộc: Giới: Plantae (Thực Vật) Nghành: Magnoliophyta Lớp: Monocotyledones (lớp một lá mầm) Bộ: Asparagales Họ: Orchidaceae Họ phụ: Epidendroideae Tông: Cypripedioideae Chi : Paphiopedilum Tên thường gọi: Lan Hài I.2. Đặc điểm sinh học: Paphiopedilum nói chung thuộc loại lan sống phụ sinh trên các bờ đá, vách núi có phủ một lớp mùn mỏng. Cây gần như không có thân hoặc thân rất ngắn. Cây mọc chụm lại với nhau thành từng cụm một. Mỗi cây có khoảng 2-5 chiếc lá. Thường lá ngắn thì có đầu tròn chia 2 thuỳ không đều; lá dài thì lại hẹp và nhọn ở đầu. Lá lan hài thường có vân xanh và mặt dưới có màu tim tím hay xanh đậm, rất đẹp. Trục phát hoa trổ từ gốc cao khoảng 10-30cm, thường mang hoa đơn, khá lớn so với thân cây. Cánh đài trên phát triển to gần như xoè tròn, hai cánh đài dưới dính vào nhau trông như một; cánh môi phát triển thành hình chiếc hài rõ rệt, và hai cánh hoa tròn hay thuôn dài tuỳ theo giống. Đa số Paphiopedilum có hoa màu vàng, xanh và nâu đỏ. Cánh hoa thường có sọc và các nốt nâu tím ở rìa cũng như lông rất mịn. Nhưng cũng có loài có hoa trắng ngần có chấm nhỏ màu ngọc tím.  I.3. Tình hình phân bố: Giống Paphiopedilum gồm 66 loài phân bố từ Ấn Độ, Niu Ghinê và vùng Đông Nam Á , người Pháp gọi loài thuộc giống này là hài vệ nữ (Sabot de Venus) và người Anh dùng với ý nghĩa tương tự (Lady’s slippers). Lan Hài được chia làm hai nhóm chính tuỳ theo khu vực sinh sống: Nhóm 1: gồm Paphiopedilum là chi lan hài duy nhất sống ở vùng Đông Nam Châu Á Chi lan hài với khoảng 80 loài trong tự nhiên được Pfitzer phân loại và đặt tên vào năm 1886. Paphiopedilum có tên từ chữ Hy Lạp Paphos (tên của một thành phố trên đảo Cyprus) và pedilon (nghĩa là hài, giầy). Trước kia nhiều giống trong chi Paphiopedilum được sắp lẫn lộn trong chi Cypripedium nhưng từ năm 1959 giới khoa học thực vật đã thống nhất dùng tên Paphiopedilum cho các giống lan hài sinh sống ở vùng Đông Nam Á. Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam là cái nôi của rất nhiều loại lan đặc trưng trong đó có lan Hài.Theo sự thống kê, Việt Nam có khoảng hơn 20 loài lan hài như: trước tiên phải kể đến lan hài đỏ (P. delenatii); lan hài vàng (P. villosum); lan hài tía (P. purpurathum); lan hài trắng (P. emersonii); lan hài vân (P. callosum); lan hài vân duyên (P. amabile); lan hài đốm (P. concolor), lan hài lông (P. hirsutissimum); lan hài râu (P. parishii)...Trong đó, nhiều loài đặc hữu, chỉ có ở một vùng hẹp như: 1. Hài Thái (Paphiopedilum appletonianum) 2. Hài đẹp (Paph. Bellatulum) Hài Đẹp (Paph. bellatulum)- hài chó đốm Hài Thái (Paphiopedilum appletonianum)- hài cánh sen 3. Hài Vân (Paphiopedilum callosum 4. Paph. hiepii var album : hài hiệp đột biến Paph. hiepii var album : hài hiệp đột biến Hài Vân (Paphiopedilum callosum) 5. Hài Đốm (Paph. concolor)- hài gấm Lan hài nở hoa vào mùa Xuân và mùa Thu và có một hoa mỗi cụm, hoa màu vàng có lốm đốm nâu dài 4 inch, bán kính 2 3/3 inch, lá rộng 3,6 cm, dài 15 cm (6 inch).Lan hài đốm phân bố ở Myanma, Thái Lan, Việt Nam như tại miền Bắc Việt Nam. Hài Đốm (Paphiopedilum. concolor) 6. Hài Hồng (Paph. delenatii): là cây hài đầu tiên trên thế giới có chuẩn hoa tròn kín rất đẹp,đặc biêc lại có mùi thơm Trong các giống lan hài ở Việt Nam nổi bật nhất phải kể đến Hài Hồng – Paphiopedilum delenatii. Khoảng 90 năm trước (1913-1914), những quân nhân Pháp mang từ Việt Nam về "mẫu quốc" một giống hoa lan đặc hữu mà người Việt gọi là lan hài đỏ, hài gấm hoặc hài hồng; rồi bán cho ông Delenat - một nhà thực vật học. Từ những cây hoa này, ông Delenat đã nhân thêm ra để nuôi trồng và đề nghị nó được mang tên ông: Paphiopedilum Delenatii. Kể từ đó, cái tên "lan hài đỏ" (hoặc hồng, gấm) được thay vào là một cái tên rất Tây: Delenatii. Là loài thực vật thấp nhỏ sống trên ghềnh đá dưới tàn cây thưa nơi lưng chừng núi, độ cao khoảng 800 m. Loài cây này có lá thuôn bầu dục hẹp, trổ hoa rộ dịp giáp Tết. Hoa mầu phớt hồng, thoảng hương thơm, cánh môi dạng túi gần tròn và hồng tía, trông y hệt chiếc hài nhung Paph. delenatii : hài hồng, cây này được giới thiệu rộng rãi ở Mỹ và được lai tạo với các loại hài khác rất nhiều Paph.delanatii var album . Hài hồng đột biến 7. Hài Trắng (Paph. emersonii)- hài hương lan Lan hài emersonii là một giống lan có cánh hoa mầu trắng, tròn và lớn với chiếc mũi (pouch) mầu vàng cam. Từ lâu, cây lan này được coi như là một cây đặc hữu của Trung Quốc. Những cây lan này thường mọc trong rừng cây có lá lớn, xanh tốt quanh năm, có những khoảng trống khô ráo, đất đá lở ở cao độ 550-750 m trên núi đá vôi. Nghiên cứu sơ khởi cho biết Paph. emersonii mọc ở những phần nhỏ của khu vực núi đá vôi thuộc tỉnh Bắc Cạn và phía bắc tỉnh Thái Nguyên.  Hài Trắng (Paph. emersonii) 8. Hài Lục (Paph. gratrixianum): Có lá thuôn lớn, dài 20 cm, rộng 4 cm; hoa to 10-12 cm, mầu lục ngả sang vàng, cánh môi dạng túi nâu nhạt. Còn gọi là đuôi công, hài Tam Đảo (đặc hữu Đông Dương). Hài Tam Đảo nở hoa tự nhiên vào tháng 10 tới tháng 12. Chúng sống trên các sườn dốc núi đá ở độ cao 900-1.100m so với mặt nước biển. 9. Hài Lùn (Paph. helenae): hài hê len Paphiopedilum helenae được Averyanov phát hiện lần đầu ở Cao Bằng vào tháng 10 năm 1995. Averyanov đã lấy tên của vợ là Helen để đặt cho cây lan này. Hài helenae thuộc loài lan đất mọc trong hốc đá ở Cao Bằng và Nam Trung Quốc. Cây có 3-4 lá, hình trái xoan thuôn, dài 4-12cm, rộng 1-2cm có 3 răng ở đỉnh. Lá màu lục đậm, vân màu trắng ngà, gốc lá có đốm tím. Phát hoa mang hoa đơn, cuống hoa có lông mịn. Hoa lớn khoảng 5-7cm, cánh đài màu vàng tươi viền trắng. Cánh tràng màu cam nâu nhạt, có vài sọc màu đỏ nhạt. Cánh môi màu vàng nâu nhạt, dạng túi phình ở đáy.Cây trong tự nhiên ra hoa vào khoảng tháng 9 đến tháng 11.Cây này được giới thiệu tại VN Paph. helenae var. sanderae 10. Hài Bắc (Paph. henryanum)- hài hen ry Hài Hằng nở hoa tự nhiên từ tháng tư tới tháng 5. Loài này thường sống trên các kẽ đá phủ rêu trên vùng núi đá vôi ở độ cao khoảng 450-750m ở miền Bắc VN. 11. Hài Lông (Paph. hirsutissimum)  12.Hài Râu (Paph. parishii) 13. Hài Tía (Paph. purpuratum) 14. Hài Vàng hay Kim hài (Paph. villosum). Loài lan đất hay sống phụ sinh, thân ngắn. Lá hình giải, dài 30cm - 45cm, rộng 3 - 4cm, đỉnh chia 2 thùy tròn, mặt trên màu lục bóng, mặt dưới có các đường vằn tiá sát góc. Cụm hoa thẳng, dài 20 - 30cm, có lông, đỉnh có 1 - 2 hoa. Hoa lớn 12 - 15cm, màu hồng, cánh đài lưng màu lục có vân dọc, mép trắng hơi lật ra sau. Cánh tràng hơi chúc xuống và cong ra phía trước, mép răn reo, giữa có vạch lớn màu nâu đỏ. Cánh môi dạng túi màu vàng lục hơi nâu mép màu vàng nâu và thùy bên cuộn vào trong. Phân bố:Cây mọc và trồng ở Đà Lạt (Lâm Đồng) và phân bố ở Lào, Thái Lan, Mianma, Ấn Độ. Nhóm 2: gồm các chi còn lại như Cypripedium, Phragmipedium, Mexipedium, Selenipedium sống ở vùng Bắc Á, Âu châu và Mỹ châu. 1. Cypripedium : Chi lan hài Cypripedium có khoảng 47 loài sống ở những vùng khí hậu lạnh như miền Bắc Mỹ, Âu Châu và Bắc Á.Các giống lan hài này có thể chịu lạnh rất giỏi, mọc ngầm dưới tuyết và nở hoa ngay lúc tuyết bắt đầu tan. Cây thuộc loài lan đất, mọc thành cụm, có thân ngầm và thường niên. Lá thường có lông tơ mịn phủ mặt hình oval hay mũi mác, màu xanh non. Đa số các loại trong chi này có trục phát hoa mọc từ ngọn vươn cao thẳng lên và có lá mọc so le dọc theo thân trục; ngoài trư giống Cypripedium acaule. Hoa đơn hay thành cụm lên đến 12 hoa (như loài Cypripedium californicum) nhưng đa số thường mang từ 1 đến 3 hoa. Hoa có cấu trúc tương tự như Paphiopedilum. Đặc trưng nhất trong chi Cypripedium là loài calceolus. Hài Cypripedium đã nằm trong sách đỏ và đang được bảo vệ vì sự đô thị hoá quá độ làm thay đổi môi trường sống cũng như thu hẹp khu sinh sống của chúng. Cypripedium californicum 2. Phragmipedium: Chi lan hài Phragmipedium có khoảng 20 loài sống ở Mexico, Trung và Nam Mỹ. Rolfe đã đặt tên và phân loại chúng vào năm 1896. Phragmipedium thuộc loại lan đất , phụ sinh trên đá. Cây cao đến 80cm có lá mọc dọc suốt hai bên thân. Lá dài cả 1m màu xanh non. Trục phát hoa mọc từ đỉnh cao đến 80cm, mang 1-3 hoa ở ngọn. Một số loài trong chi này có cánh hoa rất dài, đến 50cm, rũ thòng xuống và xoắn lại như rubăng trông rất lạ mắt. Nổi tiếng nhất trong chi lan này phải kể đến Phragmipedium besseae. Phrag. besseae được Elizabeth Locke Besse lần đầu tiên phát hiện ở Peru vào năm 1981. Ngay lập tức khu vực này bị những kẻ săn lan đào bới hủy hoại. May mắn thay những hạt giống của Phragmipedium besseae đã được tâp đoàn Elizabeth thu thập và bảo quản để nhân giống đại trà. Ngoài ra Phragmipedium caudatum, lindleyanum, longifolium cũng là những đại diện đặc sắc cho chi lan hài này. 3. Selenipedium Chi lan hài có khoảng 6 loài sinh sống ở Trung và Nam Mỹ. Selenipedium được Reichenbach đặt tên và phân loại vào năm 1854. Tên Selenipedium có từ chữ Hy Lạp là selen (moon - mặt trăng) và pedium (slipper – hài). Selenipedium rất khó trồng trong nhà; và trong thiên nhiên chúng cũng rất hiếm thấy nên chi lan này cũng đang được bảo vệ tránh sự diệt chủng. Thân cây cao khoảng 50cm. Trục phát hoa có thể mang đến 50 hoa nhỏ, hoa thường có màu hồng hay maroon, rất đẹp. 4. Mexipedium: Chi lan hài chỉ có một giống duy nhất Mexipedium xerophyticum. Mexipedium xerophyticum được tìm thấy lần đầu ở Oaxaca Mexico và chỉ có ở đó mà thôi. Hơn nữa lúc phát hiện, người ta chỉ thu hoạch được có 7 cây mà thôi.Lúc đầu xerophyticum được Soto Arenas, Salaza và Hagsater mô tả và sắp vào trong chi Phragmipedium vào năm 1990. Đến năm 1992, Albert & Chase ứng dụng kỹ thuật phân tích phân loại thực vật hiện đại dựa trên cấu trúc DNA đã sắp vào chi riêng biệt Mexipedium. Tên Mexipedium để chỉ nguồn gốc của cây ở Mexico và xerophyticum có nghĩa preferring dry conditions (thích hợp điều kiện khô). Từ số lượng nhỏ ban đầu, giới khoa học hoa lan đã nhân giống và mang trồng lại ở khu nguyên sinh của chúng đã giúp cho mọi người biết đến được nét đẹp kỳ lạ và đặc biệt của một loài lan hài cực hiếm. Cây của Mexipedium xerophyticum không mọc liền nhau thành cụm mà mọc cách nhau khoảng vài cm. Lá màu xanh bạc, nhỏ và hơi đứng thẳng lên. Hoa nhỏ màu trắng hồng rất lạ mắt. II. Vi Nhân Giống Lan Hài II.1 Giới thiệu vi nhân giống Vi nhân giống là phương pháp nhân giống vô tính in vitro, với phương pháp này người ta có thể nhân giống rất nhiều loại cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà các phương pháp nhân giống vô tính cổ điển không thể thực hiện được. Một số phương pháp nhân giống vô tính in vitro được áp dụng như: nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, đốt thân, cành bên, tạo cơ quan bất định từ các mẫu mô nuôi cấy… Một qui trình nhân giống in vitro cơ bản gồm các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ. Cây mẹ cần phải sạch bệnh và đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống mới cho hiệu quả cao. Giai đoạn 2: Khử trùng mẩu cấy, ở giai đoạn này một phần thích hợp của thực vật được khử trùng và chuyển vào môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Những mẫu cấy còn sống sau khi khử trùng sẽ được chuyển sang giai đoạn 3. Giai đoạn 3: Tăng sinh. Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh số lượng cá thể bằng sự tự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bất định. Các chồi tăng trưởng mạnh, đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyển sang giai đoạn 4. Giai đoạn 4: Ra rễ in vitro. Ở giai đoạn này những chồi đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyển sang môi trường kích thích rễ. Trong môi trường này cần phải bổ sung auxin để cảm ứng rễ và nồng độ khoáng thường giảm so với môi trường tăng sinh. Giai đoạn 5: Giai đoạn ra rễ in vivo, với những cây không ra rễ in vitro thì sẽ được chuyển ra vườn ươm để ra rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh. II.2 Một số phương pháp vi nhân giống lan hài đã được nghiên cứu Trước kia, do Lan Paphiopedilum là giống lan đa thân nên người ta thường phương pháp tách bụi để nhân giống, đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và cây con tách ra có tỷ lệ sống cao nhưng do không đáp ứng đủ nhu cầu cây giống nên ngày nay người ta ít sử dụng phương pháp này. Ngày nay, phương pháp nhân giống vô tính in vitro cũng đã được ứng dụng ở Lan Hài và đã đem lại những thành công mới. Tại Phân Viện Sinh Học Đà Lạt, Lan Hài Đỏ (Hồng Hài) - một giống hoa lan quý hiếm vừa nhân giống thành công bằng phương pháp ứng dụng công nghệ tế bào thực vật. Sau nhiều lần thử nghiệm nhân giống song chưa có kết quả, từ hai năm qua, những nhà khoa học ở Phân viện sinh học Đà Lạt lại áp dụng phương pháp mới trong nhân giống hoa lan hài đỏ. Đó là phương pháp gây vết thương, nuôi cấy lỏng theo công nghệ tế bào thực vật. khi dùng phương pháp này, khả năng tạo chồi rất nhanh, mặt khác cũng tìm được điều kiện sinh thái cho Lan Hài nở hoa.Vốn dĩ lan hài đỏ chỉ phân bố trên khắc nghiệt nhưng khi về nghiên cứu ở Phân Viện Sinh Học Đà Lạt thì lại nở hoa nhiều lần trong năm. Qua đây, người ta cũng chứng minh rằng Lan Hài Đỏ cũng có thể sản xuất vô tính. Đặc biệt, ở Việt Nam bằng phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm & bằng hóa chất và kỹ thuật sinh học, đặc biệt là kỹ thuật gây vết thương trên cây con trong ống nghiệm , các nhà khoa học thuộc Viện Ứng dụng công nghệ vừa nhân giống thành công hai loài lan hài quý: Hài Hằng (đặc hữu Việt Nam) và Hài Tam Đảo (đặc hữu Đông Dương). Hai loài lan hài này nhân giống rất khó vì hạt lan hài rất nhỏ, dài chừng 1 tới 2 milimét, rộng 1 milimét, chứa rất ít hoặc hầu như không có chất dinh dưỡng dự trữ tạo điều kiện thuận lợi cho hạt nảy mầm. Do đó, nếu gieo hạt trong môi trường đất bình thường, thì hạt dễ bị mất mát và khó sinh trưởng. Vì vậy, qua nhiều lần thử nghiệm với nhiều môi trường khác nhau, các nhà khoa học đã tìm được môi trường thuận lợi nhất cho mỗi loài đạt tỷ lệ nảy mầm cao nhất và quy trình nhân giống hai loài lan quý bằng phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm đã được xây dựng. Đồng thời, các nhà khoa học cũng đã tìm ra phương pháp tách mầm như một biện pháp bổ sung để nhân giống Hài Hằng (Paphiopedilum hangianum) và Hài Tam Đảo (Paphiopedilum Gratrixianum). Cùng với đó, các nhà khoa học bước đầu nghiên cứu thành công việc nuôi trồng những cây con trên trong vườn ươm để đưa chúng trở về với tự nhiên. Cây con được đưa từ ống nghiệm ra vườn ươm Hạt Hài Hằng và Hài Tam Đảo nảy mầm trong ống nghiệm Thụ phấn cho Hài Tam Đảo Thụ phấn cho Hài Hằng Hạt Hài Hằng và Hài Tam Đảo nảy mầm trong ống nghiệm Quả Hài Hằng và Hài Tam Đảo được thu hái để tách lấy hạt  Cây con được đưa từ ống nghiệm ra vườn ươm Cây con sinh trưởng trong ống nghiệm Hài Hằng nở hoa tự nhiên từ tháng tư tới tháng 5. Loài này thường sống trên các kẽ đá phủ rêu trên vùng núi đá vôi ở độ cao khoảng 450-750m ở miền Bắc VN. Hài Tam Đảo nở hoa tự nhiên vào tháng 10 tới tháng 12. Chúng sống trên các sườn dốc núi đá ở độ cao 900-1.100m so với mặt nước biển. Thành công nói trên mở ra triển vọng nhân giống, tiến tới ươm cây con của lan Hài Hằng và Hài Tam Đảo tại các khu bảo tồn rồi đưa chúng trở lại tự nhiên. II.3 Nhân giống Lan Hài bằng phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm II.3.1. Sự hình thành các phương pháp gieo hạt Lan Vì hạt Lan Hài quá nhỏ, không chứa dữ liệu và chỉ có một phôi chưa phân hóa, nên không thể phát triển theo một phương cách bình thường được. Vì vậy làm cho hạt nẩy mầm và phát triển thành cây Lan trưởng thành là vấn đề khó khăn trong giai đoạn đầu của thời kỳ phát triển nghành Lan. Người trồngLan đã tìm nhiều cách để gieo hạt nhưng không thành công. Đến năm 1884, Neumann, người làm vườn Pháp, đã làm nảy mầm một số hạt lan bằng cách rải đại chúng trên các cục đất ở quanh các gốc lan lớn. Sự thành công ấy được đồn xa lan rộng nhưng không ai biết được lý do mà các cấy nảy mầm. Dminy là người đầu tiên đã tạo được các hạt lan lai và làm nảy mầm các hạt lan ấy trước năm 1853. Nhiều lúc ông chi tạo được vài cây, mọi trường hợp khác đều bị thất bại. Vào năm 1899, Noel Bernard nhà thực vật học người Pháp, đã khám phá ra bí mật của sự nảy mầm ở hạt Lan khi khảo sát hạt Neottia nidus-avis nảy mầm tự nhiên trong từng vùng Fontainebleau ở nước Pháp. Ông thấy các cây Lan ấy đều nhiễm nấm. Sự thật thì sự liên kết giữa nấm và cây Lan con đã được khảo sát từ năm 1850, sự liên kết giữa nấm và rễ Lan đã được các nhà khoa học nghiên cứu suốt hơn nửa thế kỷ tiếp theo đó. Điều này cắt nghĩa lý do thành công của Neumann: hạt nảy mầm nhờ nấm có sẵn quanh gốc Lan lớn. Người ta đã khám ra ba loại nấm giúp nảy mầm ở hạt Lan: Rhizoctonia repens, Rhizoctonia mucorides, Rhizoctonia lanugiosa. Mỗi loài chỉ giúp nảy mầm một giống lan nhất định. Kể đến, khoảng 1922, Knudson ở Mỹ, lại thành công trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt. Knudson nhận thấy rằng với các chai cấy có chứa thạch và muối khoáng thích hợp thì khả năng nảy mầm của hạt Lan là rất ít hay không có. Nhưng nếu có nấm thì sự nảy mầm của hạt lan xảy ra rất sớm. Ông nhận thấy chỉ có một sự khác biệt giữa cây lan và hạt lan là sử dụng CO2 trong không khí: từ CO2 và nước, cây lan tạo ra hyratecacbon (gồm đường và tinh bột) theo phản ứng: nCO2 + 2nH2Oà(CH2O)n + nCO2 + nH2O Từ hyratecacbon (CH2O)n ấy và muối khoáng do rễ mang lại, cây lan đã tạo ra được các hợp chất phức tạp cần thiết cho sự phát triển của nó. Knudson nghĩ rằng hạt lan không mọc được bởi lý do đơn giản là do thiếu khả năng tạo cacbon hydrate từ CO2. Khi thí nghiệm để kiểm tra ý nghĩ ấy thì ông thành công ngay. Ông thấy rằng chỉ cần thêm 2% đường vào môi trường gieo hạt chỉ cần thạch và muối khoáng, không cần có nấm hạt Lan vẫn nảy mầm tốt. Như vậy vai trò chính yếu của nấm đối với sự nảy mầm của hạt lan là cung cấp chất dinh dưỡng. Từ đó, phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm đã hình thành. II.3.2. Thành phần môi trường: § Các chất vô cơ cần thiết cho sự phát triển của cây như: C, H,O,N, P, K ,S, Ca, Mg. Các nguyên tố cần thiết ít hơn: Fe, Cl, Mn, Zn, B, Mo. § Đường thường dùng là saccaroze, khoảng 2 – 4%, kế đến là glucoze, maltoz, fructoz, galatoz, mantoz, lactoz. § Các sinh tố (Vitamin) gồm có: Sinh tố B như B1 = Thiamin HCl ( 0.1 – 10 mg/l) B2 = Riboflavin (0.1 – 1 mg/l) B3 = Acid pantothenic (0.1 mg/l) B5 = PP, acic nicotinic (0.5 mg/l) B6 = Pyridoxin HCl (0.5 mg/l) Sinh tố H như Biotin (0.001 – 0.1 mg/l) Sinh tố C như Acid ascorbic (0.001 – 0.01 mg/l) Myo – inositol (100-1000 mg/l) § Chất điều hòa tăng trưởng gồm 2 nhóm auxin và cytokinin NAA: acid naphtyl (0.1 – 10mg/l) 2,4D: acid 2,4 diclorrophenoxyacetic (0.05 – 0.5mg/l) AIA: acid indolin acetic (0.1 – 10mg/l) Kinetin: 6 furfuryl aminopurin (0.01 – 10mg/l) BA (BAP): benzyl aminopurin (0.01 – 10mg/l) § Các chất chưa được xác định thành phần: nước dừa, nước cà chua… II.3.3. Kỹ thuật gieo hạt Khử trùng phòng gieo hạt hay tủ cấy Tẩy trùng trái Lan Trong mọi trường hợp, sau khi hái trái lan phải được rửa sạch và tẩy trùng mặt ngoài bằng cách: Rửa dưới vòi nước chảy Dùng gòn rửa trái trong nước xà phòng loãng hay nước có pha thêm vài giọt Tween hay Teepol. Rửa lại dưới vòi nước. Ngâm vào cồn 750 trong vòng 3 phút nếu trái còn xanh cứng,. trái chín già thì không cần ngâm vào cồn vì cồn sẽ làm trái khô nức ra ngay. Ngâm trái trong dung dịch tẩy như hypochlorit calci 10% hay hypochlorit natri 5% trong 20 phút hoặc clorua thủy ngân 0.1% trong 5 – 10 phút. Rửa bằng nước cất vô trùng (3 lần) Chuyển vào phòng cấy ngay Khử trùng hạt lan: Trong trường hợp khử trùng trái non hoặc trái già nhưng chưa bung hạt ra thì không cần khử trùng hạt lan.ngược lại trong trường hợp trái lan đã bị nứt ra dù nhiều hay ít đều phải tẩy trùng hạt Lan. Kết hợp với việc này, người ta cũng loại bỏ hạt lep đi bằng cách: Cho hạt lan vào ống nghiệm sạch Cho nước cất vào khoảng ¾ chiều cao của ống nghiệm Bịt miệng ống nghiệm bằng nắp vô trùng, rồi lắc cho các hạt rời ra. Đem ly tâm: các hạt tốt sẽ ở đáy ống nghiệm, các hạt lép sẽ nổi lên trên mặt ống nghiệm. Đổ nước trong ống nghiệm ra để tách hai thứ ấy. Vì vậy ta chỉ cần tẩy trùng mặt ngoài của hạt lan bằng dung hypochloorit calium Ca(ClO)2.4H2O, hay bằng peroxide hydrogen (H2O2). Việc khử trùng hạt lan rất đơn giản, chỉ cần rót dung dịch tẩy pha chế khi nãy vào ống nghiệm khoảng ¾ của ống. các hạt Lan sẽ đổi màu. Lắc nhẹ trong 3 phút để các hạt lan được rời ra và được tẩy sạch. Nếu hạt nặng thì sẽ chìm dưới đáy ống nghiệm, chỉ cần đổ nhẹ phần nước bên trên. Nếu hạt nhẹ thì chúng nổi trên mặt, bây giờ phải dùng ngón tay cái để bịt miệng ống nghiệm , lộn ngược lại cho chất tẩy theo ra theo hướng ngón tay cái. Hạt lan nhẹ nổi ở trên sẽ được giữ lại ở thành ống nghiệm. Gieo hạt vào chai cấy: Trong trường hợp trái non hay già chưa nứt ra thì sau khi khử trùng mặt ngoài tủ cấy như đã trình bày, trước khi cắt trái trong tủ cấy vô trùng nên khử trùng mặt ngoài trái một lần nữa bằng cách dùng kẹp nhúng trái vào cồn và đốt nhanh qua ngọn lửa. khi lửa tắt, bắt đầu mổ xẻ trái lan bằng dao mổ đã hơ qua ngọn lửa để khữ trùng, cắt một đầu của trái lan, trái sẻ bung ra dễ dàng. Cho hạt lan vào các ống nghiệm hay chai cấy đã có môi trường cấy vô trùng thích hợp mà không cần tẩy trùng hạt lan. Trong trường hợp trái đã nứt ra thì sau khi khử trùng mặt ngoài của hạt, chuyển vào tủ cấy để gieo. Hơ miệng hút (dropper) hoặc que cấy đã vô trùng đưa hạt lan đã khử trùng trong ống nghiệm cho vào chai cấy có sẵn môi trường thích hợp. Cũng có thể đổ thẳng ống nghiệm chứa hạt lan đã khử trùng vào chai cấy. Xúc lấy một số hạt lan vừa đủ để cấy sang chai cấy. Que cấy có mặt lan đưa trên mặt thạch của chay cấy để nằm ngang sao cho hạt lan rơi đều trên mặt thạch. Hạt sẽ bám vào mặt thạch và rãi đều ra. Trong trường hợp dùng ống hút hay ống đổ thẳng ống nghiệm có chứa hạt lan vào chai cấy thì sau đó phải nghiêng các chai cấy qua lại cho các hạt lan được trãi đều trên bề mặt của thạch. Đậy nắp chai cấy lại. Nếu dùng gòn để đậy thì phải đốt nhanh qua ngọn lửa và đậy nhanh lại thì lửa ở gòn sẽ tắt ngay. Nếu dùng nút cao su nhét gòn để đậy thì phải bôi thuốc vào nút chai trước khi đậy. Thuốc bôi nút chai, nút gòn để đề phòng vi khuẩn vào làm nhiễm chai cấy. Các thứ thuốc đó là: Acid salicylic 10g hòa với một lít cồn 40%. Clorua thủy ngân hòa với 5 lít nước cất. Lao bề ngoài chai cấy bằng que có đầu gòn nhúng hypochlorit. Bịt đầu nút còn lại bằng giấy bạc hay giấy tẩm paraffin hay giấy nylon để tránh mất nước của môi trường cấy. Ghi trên chai cấy các chi tiết: ngày lai, ngày cấy, tên… Để các chai cấy vào phòng nuôi thích hợp. Sự phát triển của hạt lan trên môi trường gieo cấy: Sự phát triển của hạt lan thông thường theo sơ đồ 1: Hạt lan tiền phôi tiền củ cây con (seed) (proembryo) (protocorm) (seeding) Do tác động của môi trường xung quanh, nhất là thành phần của môi trường gieo hạt, hạt lan có thể phát triển theo sơ đồ 2: Hạt lan tiền phôi tiền củ Cây con Mô sẹo Đỉnh ngọn Sinh mô bì Khối tế bào Rễ Mô sẹo Tế bào dạng nhu mô DƯỚI MỨC NÀY SẼ BỊ BIẾN DỊ VÀ HỦY DIỆT Đơn bào dạng rễ Hóa sợi cứng Như vậy hạt lan có thể ra tiền củ ( protocorm )hay mô sẹo (callus). Lấy mô sẹo hay tiền củ này đem nhân lên dưới hình thức nhân mô thì sẽ làm gia tăng số lượng cây con, từ chỉ một hạt. Nhưng cách này không nên thực hiện vì đặc tính của hạt ấy sẽ cho cây hoa như thế nào ta chưa biết rõ. Chăm sóc chai cấy: Sau khi gieo hạt xong, đem để các chai cấy nơi mát mẻ, thoáng gió, không có ánh sáng. Khoảng một tháng sau tiếp xúc dần dần với ánh sáng. Ánh sáng thường được ưa chuộng là ánh sáng ban ngày nhưng không nên để nắng rọi trực tiếp vào. Trong trường hợp cần thì phải thắp sáng bằng đèn neon, đặt cách chai cấy khoảng 40cm. Cần có 8 giờ tối mỗi đêm. Nhiệt độ nơi để chai cấy không nên quá biến đổi, thường 22 – 270C. Thường từ 2 – 3 tuần sau khi gieo, hạt bắt đầu nảy mầm. chúng phù lên có màu vàng hay trắng rồi dần dần chuyển thành xanh khi cho tiếp xúc với ánh sáng vì đã tạo được diệp lục tố (khoảng 6 tuần sau). 1 – 2 tháng nữa, trên hạt xuất hiện lá mầm, lúc bấy giờ cây sẽ quang hợp tạo ra chất hữu cơ cho sự tăng trưởng và phát triển của nó. Các rễ sẽ xuất hiện dưới dạng lông tơ trắng. Tiếp tục phát triển lá và rễ dài ra để hoàn thiện thành một cây con. Tốc độ tăng trưởng nhanh hay chậm là tùy thuộc vào loài lan và môi trường nuôi cấy có hợp không. Cấy chuyền Khi đã nảy mầm, hạt biến đổi thành một đám tế bào mà tạm gọi là tiền c