Kỹ thuật thao tác trên ADN

KỸ THUẬT THAO TÁC TRÊN ADN CHƯƠNG I : KỸ THUẬT PCR Kỹ thuật PCR là kỹ thuật phản ứng trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) . Đây là phương pháp in vitro để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó, có độ nhạy rất cao, mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban đầu hạn chế. Kỹ thuật này chỉ là sự mở rộng trực tiếp khác nhau để làm cho việc tách dòng và thao tác với AND dễ dàng và hiệu quả hơn. Kỹ thuật này đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử, chẩn đoán các bệnh di truyền người, di truyền quần thể, phân tích pháp y,…. Dưới đây, chúng ta đề cập đến một số nguyên tắc cơ bản và ứng dụng thích hợp của kỹ thuật PCR trong nghiên cứu tách dòng và chẩn đoán bệnh di truyền ở người. I. Các giai đoạn của PCR Để tiến hành PCR cần có hai mồi (primer) oligonucleotit dài khoảng 17 đến 30 nucleotit có trình tự bố sung với trình tự đích ( trình tự nucleotit liền kề với đoạn AND cần nhân). Một mồi có trình một mạch của AND, giả sử giống với mạch có nghĩa, thì mồi kia có trình tự giống với mạch đối nghĩa. Theo nguyên tắc bổ sung, mồi có trình tự mạch đối nghĩa sẽ gắn với mạch có nghĩa còn mồi kia sẽ gắn với mạch đối nghĩa đẻ khởi động quá trình tổng hợp mạch mới. Phản ứng PCR được chia làm ba giai đoạn như minh hoạ trên hình I.1. Chu kỳ gồm các giai đoạn biến tính - gắn mồi – kéo dài chuỗi được lặp lại khoảng 20 -30 lần, đảm bảo nhân bội một cách hiệu quả một đoạn trình tự AND đặc hiệu. Có thể tóm tắt ba giai đoạn đó như sau: I.1. Gây biến tính AND : Dùng nhiệt để tách hai mạch của AND đích. Nhiệt độ thường dùng là 940C. I.2. Gắn mồi: Hai mạch của AND đích được làm lạnh trong sự có mặt của các mồi. Các mồi nhận biết và gắn vào các mạch của AND theo nguyên tắc bổ sung. Các mồi được thiết kế sao cho đầu 3` định hướng đoạn trình tự cần nhân nên quá trình tổng hợp AND sẽ diễn ra trên cả hai mạch, qua suốt trình tự đó. Nhiệt độ để gắn mồi phụ thuộc vào độ dài, trình tự của mồi và mức độ đặc hiệu cần thiết ở mỗi phản ứng PCR cụ thể. Nhiệt độ gắn mồi thường dao động từ 45 – 600C. I.3.ADN polymerase gắn vào đầu 3` tự do của mồi và sử dụng dNTP để tổng hợp các mạch mới theo chiều 5`- 3`. Những thí nghiệm PCR đầu tiên thường dùng đoạn Klenow của AND polymerase I làm enzym tái bản nhưng do nó bị phân hủy bởi nhiệt ở giai đoạn biến tính nên thường phải bổ sung enzym mới. Việc phát hiện và sử dụng Taq AND polymerase từ vi khuẩn chịu nhiệt Bai dich cua thay Viet lai dân số đột biến xảy ra là N, tần số alen ban đầu của một đột biến mới sẽ là 1 / (2N) cho một sinh vật lưỡng bội.Làm thế nào để một đột biến hiếm hoi như vậy trở thành cố định trong dân số, và vì thế trở thành một char acteristic của các loài chứ không phải là của một bộ gen cá nhân cụ thể?Câu trả lời cho câu hỏi này phụ thuộc vào những hậu quả chức năng của đột biến. Nếu đột biến có ảnh hưởng đáng kể hại, nó chỉ đơn giản là sẽ được loại bỏ bằng cách tinh chế lựa chọn và sẽ không trở thành cố định. (Trong trường hợp cực đoan nhất, cá nhân khi tiến đột biến sẽ chết mà không có con cháu sản xuất). Ngược lại, đột biến hiếm hoi mà ban một lợi thế lớn sinh sản cá nhân kế thừa họ có thể lây lan nhanh chóng trong dân số. Vì con người sinh sản hữu tính và tái tổ hợp di truyền xảy ra mỗi khi giao tử được hình thành (được thảo luận trong chương 5), bộ gen của mỗi cá nhân đã thừa hưởng đột biếnCâu trả lời cho câu hỏi này phụ thuộc vào những hậu quả chức năng của đột biến. Nếu đột biến có ảnh hưởng đáng kể hại, nó chỉ đơn giản là sẽ được loại bỏ bằng cách tinh chế lựa chọn và sẽ không trở thành cố định. (Trong trường hợp cực đoan nhất, cá nhân khi tiến đột biến sẽ chết mà không có con cháu sản xuất). Ngược lại, đột biến hiếm hoi mà ban một lợi thế lớn sinh sản cá nhân kế thừa họ có thể lây lan nhanh chóng trong dân số. Vì con người sinh sản hữu tính và tái tổ hợp di truyền xảy ra mỗi khi giao tử được hình thành (được thảo luận trong chương 5), bộ gen của mỗi cá nhân đã thừa hưởng đột biến sẽ là một khảm tái tổ hợp độc đáo của các phân đoạn được thừa kế từ một số lượng lớn của tổ tiên. Đột biến được chọn cùng với một số tiền khiêm tốn của dãy lân cận cuối cùng được thừa kế từ các cá nhân, trong đó đột biến xảy ra - chỉ đơn giản là một miếng khảm khổng lồ này. Phần lớn các đột biến không có hại không có lợi. Những đột biến chọn lọc trung lập cũng có thể lây lan và trở thành cố định trong dân số, và họ làm cho một đóng góp to lớn với sự thay đổi tiến hóa trong hệ gen. Lây lan của chúng không phải là nhanh chóng như sự lây lan của đột biến hiếm gặp thuận lợi mạnh mẽ. Trong quá trình đó như trung tính biến dị di truyền được truyền thông qua một quần thể giao phối được lý tưởng hóa có thể được decribed toán học matically bởi các phương trình là đáng ngạc nhiên đơn giản. Các mô hình lý tưởng hóa đã được chứng minh hữu ích nhất cho phân tích biến dị di truyền của con người giả định quy mô dân số không đổi và giao phối ngẫu nhiên, cũng như tính trung lập có chọn lọc cho các đột biến. Trong khi không phải của hai giả định nắm tay là một mô tả tốt của lịch sử dân số của con người, họ vẫn cung cấp một điểm khởi đầu hữu ích để phân tích - các loài biến đổi. When a new neutral mutation occurs in a constant population of size N that is undergoing random mating, the probability that it will ultimately become fixed is approximately / (2N). For those mutations that do become fixed, the average time to fixation is approximately 4N generations. A detailed analysis of data on human genetic variation suggests an ancestral population size of approximately 10,000 during the period when the current pattern of genetic variation was largely established. With a population that has reached this sizse, the probability that a new, selectively neutral mutation would become fixed is small (5 x 10- 5), while the average time to fixation would be on the order of 800,000 years (assuming a 20 – year generation time). Thus, while we know that the human population has grown enormously since the development of agriculture approximately 15,000 years ago, most of the present – day set of common human genetic variants the mixture of variants that was already present log before this time, when the human population was still small enough to allow their widespread dissemination. A GEART DEAL CAN BE LEARED from analyses of the variation among humans Even though most of the variation among modern humans originates from variation present in a comparatively tiny group of ancestors, the number of variations encountered is very large. One important source of variation, which was missed for many years, is the presence of many duplications and deletions of large blocks of DNA. According to one estimate, when any individual human is compared with the standard reference genome in the database, one should expect to find roughly 100 differences involving long sequence blocks. Some of these “copy number variations” will be very common (Figure 4 – 89), while others will be present in only a minority of humans (figure 4 – 90). From an initial sampling, nearly half will contain known genes. In retrospect this type of variation is not surprising, given the extensive history of DNA addition and DNA loss in vertebrate genomes (for example, see Figure 4 – 79). Half of humans tested had nine copies of the amylase gene (left), which produces an important enzyme that digests starch. In other humans, there has been either DNA loss or DNA addition to produce an altered chromosome, resulting from the deletion (loss) or the duplication (addition) of a part of this region. To obtain these images, stretched chromatn fibers have been hybridized with differently colored probes to the two ends of the amylase gene, as indicated. The blue lines mark the general paths of the chromatin. They have been determined by a second stain and 36: 949 – 951, 2004. With permission from Macmillan Publishers Ltd). The intra- speccies variations that have been most extensively characterized are single – nucleotide polymorphisms (SNPs). These are simply points in the genome sequence where one large fraction of the human population has one nuleotide, while another substantial fration has another. Two human genomes sampled from the modern world population at random will differ at approximately 2.5 x 106 such sites (1 per 1300 nucleotide pairs). As will be described in the overview of genetics in Chapter 8, mapped sites in the human genome that are polymorphic – meaning that there is a reasonable probability (generally more than 1 %) that the genomes of two individuals will differ at that site – are extremely useful for genetic analyses, in which one attempts to associate speccific traits (phenotyphes) with speccific DNA sequences for medical or scientific purposes (seep.560). *** Agaist the background of ordinary SNPs inherited from our prehistoric ancestors, certain sequences with exceptionally high mutation rates stand out. A dramatic example is provided by CA repeats, which are ubiquitous in the human genome and in the genomes of other eukaryotes. Sequences with the motif (CA)n are replicated with relatively low fidelity because of a slippage that occurs between the template and the newly synthesized strands during DNA replication; hence, the precise value of n can vary over a considerable range from one genome to the next. These repeats make ideal DNA based genetic markers, since most humans are heterozygous carrying two values of n at any particular CA repeat, having inherited one repeat length (n) from their mother and a different repeat length from their father. While the value of n changes sufficiently rarely that most parent child transmissions propagate CA repeats faithfully, the changes are sufficiently frequent to maintain high levels of heterozygosity in the human population. These and some other simple repeats that display exceptionally high variability therefore provide the basis for identifying individuals by DNA analysis in crime investigations, paternity suits, and other forensic applications (see Figure 8 – 47). 9 copies Probe for 5` end of amylase gene Probe for 3` end of amylase gene → DNA addition 6copies → DNA loss Figure 4 -90 Detection of copy number variants on human chromosome 17. When 100 individuals were tested by a DNA microarray analysis that detects the copy number of DNA sequences throughout the entire length of this chromosome, the indicated distributions of DNA additions (green bars) and DNA losses (red bars) were observed compared with an arbitrary human reference sequence. The shortest red and green bars represent a single occurrence among the 200 chromosomes examined, whereas the longer bars indicate that the addition or loss was correspondingly more frequent. The results show preferred regions where the variations occur, and these tend to be in or near regions that already contain blocks of segmental duplications. Many of the changes include known genes.(Adapted from J.L. Freeman et al, Genome Res. 16:949 – 961, 2006. With permission from Cold Spring Harbor Laboratory Press). While most of the SNPs and copy number variations in the human genome sequence are thought to have no effect on phenotype, a subset of them must be responsible for nearly all the heritable aspects of human individuality. We know that even a single nucleotide change that alters one amino acid in a protein can cause a serious disease, as for example in sickle cell anemia, which is caused by such a mutation in hemoglobin. We also know that gene dosage a doubling or halving of the copy number of some genes can have a profound effect on human development by altering the level of gene product. There is therefore every reason to suppose that some of the many differences between any two human beings will have substantial effects on human health, physiology, and behavior, whether they be SNPs or copy number variations. The major challenge in human genetics is to learn to recognize those relatively few variations that are functionally important against a large background of neutral variation in the genomes of different humans. Summary Comparisons of the nucleotide sequences of present – day genomes have revolutionnized our understanding of gene and genome evolution. Because of the extremely high fidelity of DNA replication and DNA repair processes, random errors in maintaining the nucleotide sequences in genomes occur so rarely that only about one nucleotide in 1000 is altered every million years in any particular line of descent. Not surprisingly, therefore, a comparison of human and chimpanzee chromosomes which are separated by about 6 million years of evolution reveals very few changes. Not only are our genes essentially the same, but their order on each chromosomes is almost identical. Although a substantial number of segmental duplications and segmental deletions have occurred in the past 6 million years, even the positions of the transposable elements that make up a major portion of our noncoding DNA are mostly unchanged. When one compares the genomes of two more distantly related organnisms such as a human and a mouse, separated by about 80 million years – one finds many more changes. Now the effects of natural selection can be clearly seen: throughpurifying selection, essential nucleotide sequences both in regulatory regions and in coding sequences (exon sequences) have been highly conserved. In contrast, nonessential sequences (for example, much of the DNA in introns) have been altered to such an extent that an accurate alignment according to ancestry is frequently not possible. Because of purifying selection, the comparison of the genome sequences of multiple related species is an especcially powerful way to find DNA (tens of thousand of multispecies conserved sequences) remains mysterious. Future experiments characterizing their functions should teach us a great deal about vertebrate biology. Other sequences comparisons show that a great deal of the genetic complexity of presentday organisms is due to the expansion of ancient gene families. DNA duplication followed by sequence divergence has clearly been a major source of genetic novelty during evolution. The genomes of any two human will differ from each other both because of nucleotide substitutions (single nucleotide polymorphism, or SNPs) and because of inherited DNA gains and DNA losses that cause copy number variants. Understanding these differences will improve both medicine and our understanding of human biology. PROBLEMS Which statements are true? Expain why or why not. 4 -1 Human females have 23 different chromosomes , whereas human males have 24. 4 -2 In a comparison between the DNAsof related organnisms such as human and mice, identifying the conserved DNA sequences facilitates the search for functionnally important regions. 4 – 3 The four core histones are relatively small proteins with a very high proportion of positively charged amino acids; the positive charge helps the histones bind tightly to DNA, regardless of its nucleotide sequence. positions where they are first assembled. 4 – 5 Gene duplication and divergence is thought to have played a critical role in the evolution of increased biological complexity. Interior of a single strand of DNA ( Problem 4 – 7). Arrows at the ends of the DNA strand indicate that structure continues in both directions. Discuss the following problems. 4 – 6 DNA isolatated from the bacterial virus M13 contains 25% A, 33%T, 22%C, and 20%G. Do these results strike you as peculiar? Why or why not? How might you explain these values? 4 – 7 Asegmennt of DNA from the interrior or a single strand is shown in Figure Q4 -1. What is the polarity of DNA from top to bottom? 4 – 8 Human DNA contains 20% on a molar basis. What are the mole percents of A, G, and T? 4 – 9 Chromosome 3 in orangutans differs from chromosome 3 in humans by two inversion events (figure Q4- 2). Draw the intermediate chromosome that resulted from the first inversion and explicity indicate the segments included in each inversion. Figure Q 4 -2 Chromosome 3 in orangutans and humans (problem 4 – 9). Differently colored blocks indicate segments of the chromosomes that were derived by previous fusions. Orangutan two inversions→ human 4 – 10 Assuming that the 30 – nm chromatin fiber contains about 20 nucleosomes (200bp/nucleosome) per 50 nm of leghth, calculate the degree of compaction of DNA associated with this level of chromatin structure. What fraction of the 10,000 flold condensation that occurs at mitosis does this level of DNA packing represent? 4 – 11 In contrast to histone acetylation, wich always correlates with gene activation, histone methylation can lead to either transciptional activation or repression. How do you suppose that the same modification methylation can mediate different biological outcomes? 4 – 12 Why is a chromosome with two centromeres (a dicentric chromosome) unstable? Would a bachup centromere not be a good thigh for a chromosome, giving it two chances to form a kinetochore and attach to microtubules during mitosis? Would that not help to ensure that the chromosome did not get left behind at mitosis? 4 – 13 HP1 proteins, a family of proteins found in heterochromatin, are implicated in gene silencing and chromatin structure. The three proteins in humans - HP1α, HP1β, and HP1γ share a highly conserved chromodomain, wich is thought to direct chromatin localization. To determine whether these proteins could bind to the histone H3 N terminus, you have covalently attached to separate beads variours versions of the H3 N terminal peptide unmodified, to determine binding speccifity of HP1 proteins (problem 4 -13). Each protein at the left was detected by immunoblotting using a specific antibody after separation by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. For each histone N terminal peptide the tatal input protein (I), the unbound protein (U), and the bound protein (B) are indicated. (Adapted from M.Lachner et al..Nature 410:116 – 120, 2001. With permission from Macmillan Publishers Ltd.) Lys – 9 dimethylated (K9 – Me), and Ser – 10 – phosphorylated (S10 – P) along with an unmodified tail from histone H4. This arrangement allows you to incubate the beads with various proteins, wash away unbound proteins, and then elute bound proteins for assay by Western blotting. The results of your “ pull down” assay for the HP1 proteins are shown in Figute Q4 -3, along with the results from several control proteins, including Pax5, a gene regulatory protein, polycomsb protein Pc1, which is known to bind to histones, and Suv39h1, a histone methyltransferase. Based on these results, which of the proteins tested bind to the unmodified tails of histones? Do any of the HP1 proteins and control proteins selectively bind to the modified histone N terminal peptides? What histone modification would you predict would be found in heterochromatin? 4 -14 Mobile pieces of DNA transposable elements that insert themselves into chromosomes and accumulate during evolution make up more than 40% of the human genome. Transposable elements of four types long interspersed elements ( LINEs), short interspersed elements ( SINEs), LTR retrotransposons, and DNA transposons are inserted more or less randomly throughout the human genome. These element are conspicuously rare at the four homeobox gene clusters, HoxA, HoxB, HoxC, and HoxD, as illustrated for HoxD in Figute Q4 – 4 , along with an equivalent region of chromosome 22, which lacks a Hox cluster. Each Hox cluster is about 100kb in length and contains 9 to 11 genes, whose differential expression along the anteroposterior axis of the developing embrypo establiches the basic body plan for humans (and for other animals0. Why do you suppose that transposable elements are so rare in the Hox clusters? Figute Q4 – 4 Transposable elements and genes in 1 Mb regions of chromosomes 2 and 22 (Problem 4 – 14). Lines that project upward indicate exons of known genes. Lines that project downward indicate transposable elements; they are so numerous (constituting more than 40% of the human genome) that they merge into nearly a solid block outside the Hox clusters. (Adapted from, E.Lander et al, Nature 409: 860 – 921, 2001. With permission from Macmillan Publishers Ltd.)