Tiểu luận Phương pháp nuôi phôi dừa trong điều kiện in vitro

Lời giới thiệu Vùng Tây Nam Bộ và duyên hải miền Trung nước ta những vùng có truyền thống trồng dừa, sản phẩm từ dừa được sử dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, mỹ phẩm, trong công nghiệp, rất gần gũi trong bữa ăn hằng ngày và nước dừa là loại nước giải khát bổ dưỡng và ngon miệng. Bên cạnh những giống dừa truyền thống, nước ta còn có một số giống dừa nhập ngoại với phẩm chất tốt và giá trị kinh tế cao như 2 giống dừa dứa và dừa sáp, được trồng nhiều ở Tây Nam Bộ, chủ yếu tập trung ở hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Trong đó, dừa sáp là loại dừa có cơm dày, ít nước, dẻo quánh, thơm ngon rất được ưa chuộng, cho giá trị kinh tế cao nhưng lại cho sản lượng ít do trong số quả dừa sáp tạo thành trong một buồng ít, mặt khác dừa sáp rất khó nảy mầm ngoài tự nhiên do nhiều lý do. Trước tình hình đó, Ở Việt Nam cũng như một số nước trồng nhiều dừa khác như Philippin, Thái Lan,… đã có nhiều nghiên cứu để nhân giống và lai tạo các giống dừa và đã có nhiều thành công. Trong phạm vi bài tiểu luận này, nhóm em xin trình bày về đặc điểm của dừa sáp, những công trình nghiên cứu về dừa, và phương pháp nuôi phôi dừa trong điều kiện in vitro. Bài làm còn rất nhiều thiếu sót , Mong thầy đóng góp ý kiến để bài tiểu luận hoàn chỉnh hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Tập thể nhóm. Tổng quan về Makapuno. Giới thiệu chung. Phân loại Kingdom: Plantae Division: Magnoliophyta Class: Liliopsida Order: Arecales Family: Arecaceae Subfamily: Arecoideae Tribe: Cocoeae Genus: Coconuts Species: Coconuts Makapuno Cây dừa sáp Dừa Sáp có nguồn gốc từ Philippines, còn gọi là Makapuno là hiện tượng đột biến gen của giống dừa cao Laguna. Từ những năm 1980, Thái Lan đã nhập dừa Sáp từ Philippines về trồng khảo nghiệm, từ đó Thái Lan đã không ngừng nghiên cứu về tính thích ứng và chọn tạo giống từ các cây dừa Sáp nhập nội này. Ông Somchai Watanayothin, chuyên gia cao cấp của Viện Nghiên cứu cây ăn quả Bangkok, Thái Lan vừa công bố kết quả nghiên cứu cải thiện giống dừa Sáp lai bằng cách sử dụng phấn hoa dừa được thu từ cây dừa Sáp trồng ở đảo dừa Sáp Vachiralongkhorn Dam, huyện Thongphaphum, tỉnh Kanchanaburi để thụ cho 5 giống dừa khác là: dừa lùn vàng Mã Lai, dừa lùn đỏ Mã Lai, dừa Dứa “Nam Hom”, dừa ngọt “Thungkhled” và dừa cao tây Phi. Cây lai từ các tổ hợp lai nói trên được trồng khảo nghiệm ngoài đồng ruộng tại Viện nghiên cứu cao su Surat Thani, huyện Thachana, tỉnh Surat Thani và Trung Tâm nghiên cứu cây ăn quả Trung, huyện Sikao, tỉnh Trung.   Trái dừa sáp Ở Việt Nam, từ năm 2002 Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu đã chọn tạo tổ hợp lai lùn vàng mã Lai x Sáp, cây lai F1 của tổ hợp lai này đang được trồng khảo nghiệm tại Trảng bàng - Tây Ninh. Đồng thời năm 2006, Trung tâm thực nghiệm Đồng Gò đã chọn tạo 2 tổ hợp lai Sáp x Dứa và Dứa x Sáp bằng phương pháp thụ phấn nhân tạo, cây lai F1 của hai tổ hợp lai nói trên đang được trồng khảo nghiệm tại Giồng Trôm- Bến Tre. Trong vài năm tới, từ kết quả khảo nghiệm này sẽ định hướng nghiên cứu tiếp theo để tạo ra giống dừa lai mới là giống dừa Sáp (đặc ruột thơm mùi dứa) lùn chất lượng cao phục vụ chế biến và du lịch, góp phần làm phong phú nguồn giống dừa Việt nam và tận dụng khai thác tối đa nguồn tài nguyên di truyền cây dừa quốc gia. Đặc điểm: Dừa sáp còn gọi là dừa đặc ruột, dừa kem, thuộc giống dừa cao, thụ phấn chéo. Ít nhất, có năm loại dừa sáp: dừa tròn, dừa dài, dừa có cạnh, dừa vỏ xanh, dừa vỏ vàng. Dựa vào độ đặc ruột của cơm dừa, dừa Sáp được chia thành 3 nhóm với kiểu đặc ruột là kiểu A, B và C với độ đặc ruột tương ứng tăng dần, với kiểu A là đặc ít, chỉ khoảng 1/3 bán kính trái dừa, và kiểu C là gần như không có nước. Quả dừa sáp có phần cơm dừa dày đến 2cm Dừa sáp trồng khoảng 4 năm có lưỡi mèo, càng về lâu về dài càng sai trái. Dừa sáp cũng giống như các loại dừa khác ở nước ta như dừa xiêm, dừa ta, dừa dâu, dừa bung, dừa bị… Nhưng dừa sáp có lớp cơm màu trắng rất dày (có khi choán hết cả phần ruột) giống như sáp đèn cầy, chính giữa là chất lỏng sệt như nước cơm chắt. Không như cơm dừa bình thường, nếu còn non thì mềm và ngọt, nếu già thì cứng cạy. Cơm dừa sáp mềm và dẻo như bột quánh lại, béo và có mùi thơm đặc trưng. Nước dừa sáp cũng vậy. Để phân biệt dừa sáp và dừa thường, người trong nghề dùng sống dao thử. Gõ sống dao vào gáo dừa đã lột vỏ. Dừa thường dày cơm gõ nghe tưng tưng, tiếng trong. Còn dừa sáp gõ nghe lộp bộp, tiếng trầm. Thông thường một quày dừa sáp có 12 trái, chỉ có khoảng 4-5 trái có sáp, thậm chí không có trái nào, tùy theo nhiều yếu tố. Dừa thường Dừa sáp Dừa thường Khác với dừa thường, dừa sáp có độ dầu cao hơn, mùi hương đặc trưng hơn. Đó là đặc điểm quý cần nghiên cứu ứng dụng trong việc sản xuất bánh kẹo và các sản phẩm khác đem lại nguồn lợi kinh tế cao. Có tài liệu cho biết, dừa sáp sau khi hái xuống, có thể sản xuất cơm dừa, thạch dừa (nata de coco), mứt dừa, kem dừa, nhựa thu được từ các cụm bông dừa được len men để sản xuất rược vang dừa (ở Philippines gọi là tuba), cơm dừa sấy khô, mụn xơ dừa, than hoạt tính….. Trên thị trường quốc tế, các mặt hàng sản phẩm từ dừa đều có giá trị kinh tế cao. Giá FOB (giá giao hàng tại cảng) của mụn xơ dừa khỏang 6.500USD/tấn, than hoạt tính (làm từ gáo dừa): 1.000 - 1.200USD/tấn, cơm dừa sấy khô: 600 - 700USD/tấn và dao động tùy theo từng thời điểm. Bảng thành phần dinh dưỡng của dừa sáp (thành phần dinh dưỡng trong 100g cùi). Moisture 64.8g Calcium 58mg Energy 194 kcal Phosphorus 59mg Protein 2.4g Iron 1.4mg Fat 17.6g Thiamine 0.02mg Fiber 5g Riboflavin 0.02mg Carbonhydrate 9.5g Niacin 0.6mg Ash 0.7mg Ascorbic acid 8mg Sản phẩm từ dừa sáp Các công trình nghiên cứu về dừa sáp: 1. Tại Việt Nam: Dừa sáp chỉ có ở Cầu Kè, Trà Vinh. Một cây dừa sáp chỉ cho ra được vài trái có ruột sáp. Mới đây, Viện Cây có dầu và Sở Khoa học – Công nghệ tỉnh Trà Vinh đã thành công trong việc thụ phấn để tăng số lượng trái dừa sáp ở mỗi cây. Kỹ sư Ngô Thanh Trung, Trung tâm Sản xuất thực nghiệm Đồng Gò cho biết ,công việc thụ phấn dừa sáp được giao cho 2 kỹ sư thực hiện. Việc thụ phấn được thực hiện trên tất cả các cây dừa sáp đang cho trái trên địa bàn huyện Cầu Kè, trung bình mỗi ngày họ phun khoảng 40–50 cây. Công việc khá cực nhọc vì phải đưa phấn đực vào đúng bông cái. Vừa phun phấn đực cho bông cái xong, nếu mưa đổ xuống, coi như công cốc, phải làm lại. Thực hiện từ sáng đến 12 giờ trưa thì nghỉ, vì sau đó, theo nhịp sinh học, bông cái thụ phấn rất ít, không đạt kết quả mong muốn. Cũng giống như thụ tinh nhân tạo cho trâu, bò, heo và cá, thụ phấn cho dừa sáp chắc chắn sẽ đạt kết quả tốt. Công việc này mới thực nghiệm, phải đợi đến 10–11 tháng sau mới biết kết quả (tính từ ngày 26-6-2007). Nhưng chắc chắn hiệu quả từ việc thụ phấn cho dừa sáp này sẽ đem đến kết quả cao. Cách thụ tinh cho dừa sáp Trước khi thụ tinh, phải lấy phấn đực trên cây sáp mới bung 2 - 3 ngày. Đây là lúc phấn đực già, đủ mạnh, bông cái sẽ thụ phấn mạnh hơn. Phấn đực (tuyệt đối không có phấn lạ) lấy về được nghiền vỡ, cho vô thùng kín, phơi ngoài trời trong bóng râm để có nhiệt độ đúng yêu cầu từ 37-40o C (có đặt nhiệt kế theo dõi). Phơi khoảng 2 ngày sẽ có mủ màu nâu, nghiền tiếp đến khi phấn bung màu vàng hột gà thì rây lấy bột mịn. Lấy một phần bột này đem thử tỷ lệ nảy mầm, nếu thấp thì bỏ tất cả; còn mạnh thì trộn với bột phấn theo tỷ lệ nhất định, cho vào dụng cụ phun tự chế gắn dài theo thân cây tầm vông khô. Dụng cụ phun gồm một cây tầm vông khô dài khoảng 5-6 thước. Một ống nhựa trong dài cũng chừng ấy thước. Một ống cao su giống trái bầu. Một bộ phận đựng phấn đực và cho phấn đực lan toả khắp xung quanh bông cái mới nở khi bóp quả bầu. Phun suốt từ 6 tới 8 ngày thì kết thúc, tùy số bông cái trên buồng. Khi bông cái thụ tinh xong, cuống chuyển sang màu nâu. Tại Trà Vinh: Sở Khoa học- Công nghệ tỉnh Trà Vinh phối hợp với Viện Nghiên cứu dầu thực vật- hương liệu- mỹ phẩm TP. Hồ Chí Minh triển khai đề tài "Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật để xây dựng mô hình chuyên canh dừa đặc ruột". Mục tiêu đề tài này nhằm lưu giữ giống dừa đặc ruột (dừa sáp) quí hiếm của địa phương và nâng tỷ lệ cho trái đặc ruột chiếm từ 80% trở lên. Đề tài này được thực hiện tại huyện Cầu Kè, trên diện tích 6 ha trồng giống dừa đặc ruột đầu dòng, trong đó, có 1ha trồng theo phương pháp cấp phôi nhập từ Philippin. Trà Vinh hiện có khoảng 1.000 cây dừa đặc ruột, tập trung chủ yếu ở huyện Cầu Kè. Do người dân tự nhân giống trồng nên tỷ lệ trái đặc ruột chiếm không cao, tối đa chỉ khoảng 30% so với tổng số trái trong mỗi buồng dừa. Nếu đề tài này thành công sẽ mở ra triển vọng mới cho nhà vườn và huyện Cầu Kè có điều kiện phát huy lợi thế khai thác tiềm năng du lịch sinh thái miệt vườn ở cù lao Tân Qui và ven sông Hậu. Phương pháp nuôi cấy in vitro phôi dừa: Giới thiệu: Kỹ thuật nuôi cấy mô có ứng dụng quan trọng trong sưu tầm, thay đổi và bảo tồn các giống dừa. Trong giới thực vật dừa là một trong những loài có hạt có kích thước lớn. Hơn nữa, chúng không có giai đoạn ngủ của hạt mầm và nảy mầm ngay sau khi quả già. Hai đặc tính này đã gây nhiều khó khăn trong việc thu gom và bảo quản giống. Một cách đơn giản và có hiệu quả để khắc phục là sử dụng kỹ thuật nuôi cấy phôi in vitro đã được nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau phát triển. Tách phôi dừa và nuôi cấy in vitro có thể bảo quản tốt trong một năm và chúng phát triển rất tốt sau thời gian đó. Nhiều dự định thiết lập nhiều ngân hàng gen dừa ở nhiều nước khác nhau (Rao và Batugal 1998), ở một số nước trồng dừa đã có nhiều chương trình nghiên cứu và nhân giống. Người ta thường sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro phôi dừa để tránh sự lây lan của dịch bệnh đên những nơi khác và giảm bớt giá thành vận chuyển. Kĩ thuật nuôi cấy phôi cây dừa được áp dụng thành công cho nuôi cấy phôi dừa sáp. Phôi Makapuno không thể phát triển bình thường vì thiếu nội nhũ là yếu tố cần thiết cho sự nảy mầm của phôi., nó sẽ bị tiêu biến khi cây trưởng thành. Kĩ thuật nuôi cấy phôi là khả năng duy nhất cho sự nảy mần của phôi dừa sáp để tạo ra Makapuno thuần chủng. Cách thức thực hiện: 2.1 Phôi dừa: Phôi dừa được tách lấy sau khi dừa già bằng một dụng cụ chuyên dụng: Tốt nhất phôi dừa được tách ra ngay sau khi quả già, đặc biệt là đối với dừa sáp vì phần thịt dừa đặc và dẻo nên dễ dàng gây thối phôi dừa. Môi trường nuôi cấy phôi in vitro: Trong nuôi cấy phôi dừa sáp, có nhiều phòng nghiên cứu sử dụng môi trường Eeuwens (Y3). Sau đây là bảng thành phần môi trường. Chemicals g/l Pha 1 lit môi trường dinh dưỡng vi lượng Y3 ở nồng độ (10x) Cân và hòa tan các chất sau trong 50 ml nước cất. Potassium nitrate (KNO3) 20.20 Potassium chloride (KCl) 14.92 Ammonium chloride (NH4Cl) 5.35 Sodium di-hydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4.2H2O) 3.12 Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) 2.94 Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H2O) 2.47 Trộn đều, định mức lên 1 lit sau đó bảo quản trong một bình tối. Pha 1 lit môi trường dinh dưỡng vi lượng Y3 ở nồng độ (100x) Cân và hòa tan các chất sau trong 50 ml nước cất. Manganese sulphate tetrahydrate (MnSO4.4H2O) 1.120 Zinc sulphate heptahydrate (ZnSO4.7H2O) 0.720 Boric acid (H3BO3) 0.310 Potassium iodide (KI) 0.830 Copper sulphate pentahydrate (CuSO4.5H2O) 0.025 Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4.2H2O) 0.024 Cobalt chloride hexahydrate (CoCl2.6H2O) 0.024 Nickel chloride hexahydrate (NiCl2.6H2O) 0.0024 Trộn đều, định mức lên 1 lit. Pha 1 lít dung dịch hỗn hợp gốc sắt Y3 (100x) Cân và hòa tan các chất sau trong 500 ml nước cất. Sodium EDTA dihydrate (Na2EDTA.2H2O) 3.73 Iron sulphate heptahydrate (FeSO4.7H2O) 1.39 Chuẩn thành 1 lit sau đó bảo quản trong bình tối Pha 1 lít dung dịch vitamin (100x) Cân và hòa tan các chất sau trong 50 ml nước cất. Myo-inositol 10.000 Thiamine-HCl 0.050 Nicotinic Acid 0.005 Pyridoxine-HCl 0.005 Ca- D-pantothenate 0.005 Biotin 0.005 Chuẩn thành 1 lit sau đó bảo quản trong bình tối. Pha loãng môi trường từ các dung dịch trên theo hướng dẫn và bổ sung thêm 45g/l đường và hòa tan các chất trong dung dịch. Điều chỉnh pH sử dụng 0,1 M NaOH hoặc 0,1 – 0,5 mHCl,E. coli Thêm 2,5 g than hoạt tính Khử trùng phôi và môi trường: Kỹ thuật nuôi cấy phôi trong điều kiện vô trùng Làm giảm sự xâm nhiễm của vsv trong nuôi cấy mô là rất cần thiết. Môi trường dinh dưỡng, nuôi cấy trong lọ, công cụ sử dụng trong nuối cấy mô và mẫu thực vật phải được vô trùng để tránh bị nhiễm khuẩn. Đối với mẫu cấy có thể sử dụng ethanol 95% hoặc 5-6% sodium hypochloriteCòn môi trường và dụng cụ cần được hấp và hơ trên ngọn lửa đèn cồn để vô trùng. Cấy phôi vào ống nghiệm: Cấy phôi vào ống nghiệm chứa môi trường Y3 Phôi sau 3 đến 4 tuần nuôi cấy Hình ảnh phôi sau khi cấy vào ống nghiệm. Cấy chuyển qua bình lớn: Khi phôi lớn chật ống nghiệm , tiến hành cấy chuyển qua bình lớn hơn: Khi cây mọc được từ 3 đến 4 lá mầm tiến hành bứng cây ra chậu, trên giá thể bột than. Sau đó chuyển ra vườn ươm. Từ vườn ươm cây sẽ được phân phối đến các vườn trồng. Để di chuyển cây giống người ta có thể di chuyển từ khi cây còn ở trong ống nghiệm hoặc cấy ra bình lớn để tiết kiệm chi phí vận chuyển. Nuôi cấy mô từ phôi của tái dừa sáp cho cây có tỉ lệ dừa sáp cao hơn so với phôi của những trái bình thường trên cây. Kết luận: Do tìm không được tài liệu nên trong bài của chúng em còn rất nhiều thiếu sót, chính bản thân chúng em cũng cảm thấy không hài lòng. Trong thời gian tới, chúng em sẽ cố gắng tìm hiểu thêm để hoàn thành tốt khi báo cáo bài trước lớp. Tài liệu tham khảo: