Đề tài Nhân giống invitro Lan Hồ Điệp

Giới Thiệu. Hiện nay Lan Hồ Điệp nói chung và các loại lan nói riêng được xem là cây trồng đem lại hiệu quả kinh tế cao. Do đó cũng đã có nhiều nhà vườn mạnh dạn đầu tư chuyển đổi cơ cấu cây trồng từ lúa, hoa màu sang trồng lan. Hiệu quả kinh tế cao gấp 2-3 lần so với cây trồng khác. Lan Hồ Điệp hiện nay rất được yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một vẻ đẹp sang trọng và trang nhã. Tuy nhiên Hồ Điệp là loài lan khó nhân giống, hiện tại chỉ có một số cơ sởm trường Đại học, Viện nghiên cứu có hướng phát triển trên những kỹ thuật mới như: Kỹ thuật nuôi cấy quang tự dưỡng, Bioreactor. v.v..nhưng vẫn chưa đưa ra áp dụng rộng rãi. Việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in-vitro tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền và đáp ứng giá cả phải chăng là rất hữu ích. Tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TPHCM nghiên cứu thàng công kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời đối với cây Hồ Điệp. Với kỹ thuật này, việc nhân giống hoa lan Hồ Điệp có nhiều ưu điểm như tỉ lệ sống của cây con trong giai đoạn vườn ươm đạt 95%.. rút ngắn thời gian để cây đạt kích thướt khi ra vườn ươm. Ở đây do một hạn chế về công nghệ cũng như thiết bị, kỹ thuật nên chỉ giới thiệu quy trình cơ bản nhân giống lan Hồ Điệp bằng phương pháp nuôi cấy mô in-vitro. Mục lục. Phần I: Tổng quan về Lan Hồ Điệp. I.1 Tên và nguồn gốc. I.2 Hình dáng. I.3 Điều kiện sinh thái. I.3.1 Nhiệt độ và độ ầm. I.3.2 Nhu cầu nước tưới. I.3.3 Ánh sáng. I.3.4 Độ thông thoáng. I.3.5 Dinh dưỡng. I.3.6 Sâu bệnh. I.3.7 Chậu, Giá thể, Cách trồng. I.4 Tình hình sản xuất ở Việt Nam. Phần II: Nhân giống invitro Lan Hồ Điệp. II.1 Lịch sử ra đời. II.2 Một số phương pháp nuôi cấy. II.3 Quy trình nhân giống. II.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến môi trường nuôi cấy. Phần III: Kết luận. Tài liệu tham khảo. PHẦN I: TỔNG QUAN VỀ LAN HỒ ĐIỆP. I.1 Tên và nguồn gốc. - Hồ Điệp có tên khao học là Phalaenopsis là loài có hoa lớn, bền, đẹp. Có tên từ chữ grec Phalaina nghĩa là bướm và opsis có nghĩa là sự giống nhau. Lan Hồ Điệp là loài lan có hoa giống bươm bướm phất phơ rất đẹp. - Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius đặt tên là Angraecum album. 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum. 1825 nhà thực vật Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis. - Hồ Điệp phân bố chủ yếu ở: Malay, Indo, Philipin, phía đông Ấn Độ và Úc. Ở Việt nam cũng có một số loài vì có hoa nhỏ nên được gọi là tiểu Hồ Điệp (phalaenopsis manni, gibbosa, lobbi, fuscata, cornucervi.). Hồ Điệp có thể mọc ở khí hậu nhiệt đới và đồi núi cao 2000m nên vừa chịu được khí nóng ẩm vừa chịu được khí hậu mát. I.2 Hình dáng Lan Hồ Điệp. Hồ Điệp là loài lan đơn thân, mập, ngắn lá to, dày mọc sát vào nhau. Đây là giống gồm các loài có hoa lớn, đẹp. Phát hoa mọc từ nách lá, dài, đơn hay phân nhánh, cánh hoa phẳng, trải rộng, hoa nở từng cái, 3 đài to tròn, 2 cánh xòa rộng kín. Môi cong, dẹp có 2 râu dài. Trụ có hình bán nguyệt với 2 phân khối u lên chứa đầy phấn hoa. Ngày nên Hồ Điệp được lai tạo với nhiều màu sắc và kích thướt đa dạng: trắng, tím, đỏ, vàng, hồng.   I.3 Điều kiện sinh thái. I.3.1 NHiệt độ và độ ẩm. - Hồ Điệp là loại hoa của nhiệt đới, nhiệt độ tối thiểu 22oC- 25oC ban ngày và 18oC vào ban đêm. Tuy nhiên Hồ Điệp là loại lan chịu nóng nhiều hơn đa số các loài khác. Cây có thể phát triển tốt ở nơi có nhiệt độ cao 35oC vào ban ngày và 25oC vào ban đêm. Nhiệt độ lý tưởng để phát triển tốt là 25oC-27oC. Hồ Điệp phát triển quanh năm hầu như không có mùa nghĩ thuận lợi trổ hoa lúc thời tiết lạnh.( Ở Việt Nam thường nở hoa vào cuối tháng 12,1.) - Hồ Điệp chịu ẩm cao, tối thiểu 60% nhưng không chịu nước. Làm gìan che phải che 70% nắng. Ẩm độ này rất phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam. I.3.2 Nhu cầu nước tưới. - Hồ Điệp là cây đơn thân nên không có giả hành để dự trữ dinh dưỡng và nước. Nước thường tập trung ở lá. Vì Hồ điệp có lá lớn, diện tích tiếp xúc nhiều nên rất dễ thoát hơi nước. Vào mùa nắng có thể tưới 3 lần/ngày: Sáng, trưa, chiều. Chú ý khi tưới vào buổi trưa phải tưới thật đẩm để tránh nắng sẽ làm sốc cây lan. Mùa mưa thì tuỳ theo điều kiện thời tiết mà tưới nước cho phù hợp. tóm lại Hồ Điệp cần ẩm nhiếu hơn nước. I.3.3 Ánh Sáng. - Hồ Điệp cần ánh sáng yếu vì đây là loài ưa bóng mát, biên độ biến thiên khá rộng 5.000 – 15.000m/m2, ánh sáng chỉ cần 20%-30% là đủ. Tuy nhiên không trồng Hồ Điệp ở nơi quá răm mát vì ánh sáng rất cần cho sự sinh trưởng và trổ hoa. Ánh sáng khuyếch tán vừa phải tất tốt. Nếu chiếu sáng được 12h/ngày thì cây sẽ phát triển tốt hơn. Ở châu Âu Hồ Điệp được trồng trong nhà kính có hệ thống làm mát, máy điều hòa nhiệt độ và ánh sáng nhân tạo nên Hồ Điệp phát triển rất đồng đều, xanh tốt. Thuận lợi cho việc điều khiển ra hoa đồng loạt. I.3.4 Độ thông thoáng. - Rất cần thiết cho Hồ Điệp, Hồ Điệp hay bị bệnh thối nhũn lá (phõng lá), sự thông thoáng giúp lá cây mau khô sau khi tưới và bộ rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh rất nhiều. Ở nước ta vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh những giọt mưa nặng hạt có thể làm thối đọt. Do đó để ngăn ngừa tình trạng trên nên dùng những tắm tôn nhựa xanh để che. Có một số trường hợp trồng Hồ Điệp trên cao (Sân thượng) có hiệu quả hơn. Tuy nhiên gió nhiều và mạnh dễ làm cây mất nước nhanh nếu ta không cung cấp đủ lá cây sẽ héo rũ, nhăn. I.3.5 Dinh dưỡng. - Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có mùa nghỉ . Khi tưới phân không nên tưới với nồng độ cao cà đừng tưới lên đọt, nhất là lúc lá non mới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng. Hồ Điệp cần phân bón tưới với nồng độ loãng và có thể tưới nhiều lần trong tuần. Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: bánh dầu 15ngày/lần, vitamin B1, kích thích ra rễ… - Cách tưới phân: + Cây dưới 12 tháng tuổi dùng phân có công thức 30-10-10, sau đó dùng phân loại 20-20-20 hoặc 18-18-18 cho đến lúc ra hoa. Tuy nhiên vào mùa mưa nếu tưới phân 30-10-10 thấy cây yếu mềm quá có thể tăng cường lượng lân và kali bằnng cách xen kẻ phân 20-20-20 hoặc 18-18-18(dù là cây con), để cây được cứng cáp, tăng cường sức đề kháng sâu bệnh. + Lúc cây trưởng thành (18-24 tháng tuổi) vào thời điểm cuối năm, thời tiết lạnh có thể kích thích cây ra hoa bằng cách tưới phân 10-30-30 đến khi cây bắt đầu nhú cành hoa rồi ta trở lại tưới phân 20-20-20 cho đến lúc hoa nở và tàn. KHông nên để cành hoa lâu quá trên cây, khi nụ hoa cuối cùng đã nở và có 1,2 hao bắt đầu héo, thì ta nên cắt cành hoa bỏ đi để dưỡng sức cho cây. Khi cắt cành hoa càng sớm thì lá mới ra mau và cây sinh trưởng tốt hơn để lần ra hoa sau sẽ mạnh hơn. I.3.6 Sâu bệnh. -Đối với phong lan, việc phòng bệnh hết sức quan trọng, vì khi cây đã bị bệnh rất khó trị và có thể làm chết cây. Ngoài việc chăm sóc lan kỹ lưỡng đều đặn, tưới nưới và dinh dưỡng cần phải tưới thêm thuốc trừ nấm bệnh nhằm tăng sức đề đề kháng cho cây. Lan Hồ Điệp hay bị con bọ trĩ chích tạo vết thương trên lá từ đó vi khuẩn xâm nhập gây bệnh thối nhũn trên lá. Có thể dùng một số loại thuốc để phòng trị như Malathion, lannat… để phòng trị I.3.7 Chậu, giá thể và cách trồng. - Cách trồng chung nhất cho các loại Hồ điệp là chậu thật thoáng, có nhiều lỗ có thể sử dụng chậu đất nung có nhiều lỗ hay chậu nhựa cũng được. Chậu phải thật sạch không có rêu bám trên thành chậu. Thông thường các nhà vườn trồng lan với số lượng lớn (vài ngàn cây) thường dùng than, dớ, xơ dừa, mút… làm giá thể để trồng lan Hồ Điệp. Có rất nhiều cách trồng lan HĐ tuỳ theo từng vùng. Nhưng có điểm chung là than, mút nằm dưới đáy chậu, còn xơ dừa hay dớn sẽ nằm trên miệng chậu. cách trồng này giúp cây thóat nước tốt vào mùa mưa, không bị thối rễ và phát triển tốt. Trong thời gian khoảng 2 năm ta thay chậu một lần, nếu cây lớn quá mau có thể thay chậu sớm hơn. I.4 Tình hình sản xuất. Hiện nay tại TP.HCM cây lan Hồ Điệp được xem là cây trồng chiến lượt trong việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng và vật nuôi. Đây là cây trồng đem lại hiệu quả cao gấp 2-3 lần so với việc trồng lúa, hoa màu v.v.. Trong xu thế đất trồng ngày càng hẹp thì cây lan không chiếm diện tích đất nhiều nên là giải pháp rất hiệu quả. Không chỉ đẹp về màu sắc, hình dáng, hoa lâu tàn… giá thành rẻ nên ngày càng được ưa chuộng và nuôi trồng. Tại TP.HCM và các tỉnh lân cận có rất nhiều vườn trồng Hồ Điệp với qui mô từ vài trăm đến vài nghìn cây. Điển hình là cty Lâm Thăng của Đài Loan đầu tư và Cty Kim Ngân chuyên trồng về lan Hồ Điệp, hàng năm có thể cung ứng cho thị trường từ vài ngàn đếm vài chục ngàn cây, nhất là vào dịp Tết Nguyên Đáng. Tuy nhiên do không có sự liên kết giữa các nhà vườn nên sản phẩm làm ra không tìm được thị trường tiêu thụ, giữa cung và cầu không hợp lý. Về nguồn cây giống thì ở nước ta do không đầu tư nên cây giống không đạt chất lượng tốt, giống mới không nhiều nên các nhà vườn thường nhập giống từ các nước như Thái Lan, Đài Loan…Ngoài ra hàng năm việc nhập khẩu hoa từ các nước này ước tính tiêu tốn hàng triệu USD. So với các nước có ngành trồng lan phát triển như Đài Loan hay Thái Lan thì ngành trồng ở nước ta cần phải học hỏi nhiều và cần phải có chích sách phát triển hợp lý nhằm đem lại hiệu qủ kinh tế cao hơn. Phần II. Nhân giống invitro lan Hồ Điệp. II.1 Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Năm 1902, nhà thông thái Haberlant lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể nhưng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công Năm 1934 White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua. Năm 1964 Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn tử môi trường nuôi cấy tối thiểu. tuy nhiên việc nhân giống cây vẫn chưc hòan chỉnh. Sau đó nhiều nhà dinh dưỡng đã tìm ra những thàng phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy. Năm 1951 Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi. Năm 1962 Murashige va Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và còn sử dụng rộng rãi cho đến ngày nay. Năm 1960-1964 Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa. từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tê bào thực vật đã được phát triển với tôc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa. II.1 Một số phương pháp nhân giống. + Phương pháp cơ học, sử lý hóa chất: Phương pháp này ko tốn chi phí nhiều, thời gian dài, nhưng cũng có một khuyết điểm như: tạo ra số lượng cây con ít, ko thể áp dụng khi trồng với qui mô lớn. Phương pháp này thường áp dụng khi trồng lan để chơi ko thể kinh doanh. + Phương pháp gieo hạt lan trên môi trường dinh dưỡng: Phương pháp này cũng ko phổ biến nhiều vì khi gieo hạt mặc dù tạo ra được số lượng lớn cây con nhưng không đồng nhất, ko thể xác định được màu sắc hình dáng hoa. Phương pháp này thường được các nhà nghiên cứu, lai tạo áp dụng khi muốn lai tạo ra giống mới. + Phương pháp cấy mô trên môi trường thạch: Hiện nay phương pháp này được áp ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam nuôi cấy mô hoa lan chủ yếu là phương pháp này. Phương pháp này giúp cho ta có thể tạo ra một lượng lớn cây con, đồng nhất… cung ứng nguồn cây giống cho các nhà vườn. Tuy nhiên do kỹ thuật nuôi cấy ở nước ta cũng chưa đạt hiệu quả tốt nên chất lượng cây con cũng ko cao. Thường thì nhập từ các nước ngoài như Thái Lan, Đài Loan… + Phương pháp nuôi cấy lỏng: Có sục khí (Bioreactor). Hiện nay, hầu hết các hệ thống vi nhân giống được thực hiện trên hệ thống bình nuôi cấy khác nhau nhưng đều có điểm là mẫu cấy đều phát triển trên môi trừơng đặc, thiết bị nuôi cấy có kích thướt nhỏ môi trường nuôi cấy không đủ đáp ứng cho nhu cầu phát triển lâu dài củ mẫu cấy. đồng thời cũng lãng phí môi trường do cây không hấp thu hết các chất dinh dưỡng ở phần đáy của bình nuôi .cấy Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng mẫu cấy có khả năng tăng trưởng nhanh hơn so với môi trường. Có thể do mẫu cấy tiếp xúc hoàn toàn trong môi trường nên có thể hấp thu tốt hơn các chất dinh dưỡng từ môi trường Ngày nay, hệ thống nuôi cấy Bioreactor với cấu trúc của các bình lên men nhưng cách khấy bằng kim loại được thay bằng các ống silicon sục khí có thể điều khiển được tốc độ dòng khí vào để hạn chế sự tương tác bất lợi của mẫu cấy, hạn chế sự tổn thương của mẫu. Do đó hệ thống Bioreactor được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau: Nuôi cấy chồi và phôi thực vật, chồi thu hải đường, củ khoai tây bi invitro, hoa lily, một số cây thân gỗ và đặc biệt là nuôi cấy thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học như: nuôi cấy rễ cây nhân sâm + Nuôi cấy quang tự dưỡng.Phương pháp này được gíao sư Kozai và các cộng sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90. Vi nhân giống bằng cách này có nhiều ưu điểm hơn phương pháp truyền thống: Thúc đẩy sự tăng trưởng của cây invitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và làm hạ gía thành. Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không sử dụng trong môi trường nuôi cấy, không có chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, amino acid, ngoại trừ các chất không được đưa vào môi trường. Sở dĩ như vậy vì chúng có thể sử dụng CO2 làm nguồn carbon trong quá trình quang hợp mà không cần đường. Nồng độ CO2 và ánh sáng là hai yếu tố quan trọng nhất trong nuôi cấy quang tự dưỡng cùng với cơ quan diệp lục tố. + Nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời. - Nguyên lý hoạt động của hệ thống này khá đơn giản. Trong bình kín, chồi cây được ngập trong dung dịch dinh dưỡng khoảng vài phút, dung dịch này rồi sau dó được rút cạn đi một cách tự động. những chu kỳ ngập rồi khô như vậy được lập đi lập lại đều đặn mỗi 6h nhờ một chiếc máy bơm không khí đã được lập trình từ trước. toàn bộ hệ thống hoạt động khép kín và được khử trùng, tránh được sự ngoại nhiễm trong quá trình thao tác. Mặc khác vì bơm không khí vào hệ thống nên ta có thể điều tiết thành phần không khí, tạo nên môi trường tối ưu cho mâm con. Trong một chiếc bình 1lít có thể tạo ra hàng trăm chồi cây lan Hồ Điệp khoẻ mạnh sau 3-6 tháng. Phương pháp này có nhiều ưu điểm như: tạo ra nguôn mẫu in-vitro dồi dào nhờ hệ số nhân của mẫu cấy rất cao, tạo ra môi trường thoáng khí, cây con khỏe mạnh, tỉ lệ sống cao, gỉam tỉ lệ nhiễm, giảm chi phí nhân công, rút ngắn thời gian… II.3 Quy trình nuôi cấy: gồm 5 g/đ. G/đ 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy. G/đ 2: Tạo thể nhân giống invitro. G/đ 3: Nhân giống invitro. G/đ 4: Tái sinh cây invitro hoàn chỉnh G/đ 5: Chuyển cây con invitro ra vườn ươm. 1 2 3 5 4 1 II.3.1 Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy. - Mẫu cấy là chồi bên mang đỉnh sinh trưởng, được đặt vào môi trường nuôi cấy. Mẫu được khử trùng bằng cồn 70%, sau đó đem rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm vào dd Ca(Cl)2 2% trong 25’. mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần. mẫu được trong đĩa petri cô trùng & cẩn thận tách các chồi non. Sau mỗi lần tách cần nhúng mẫu vào cồn 70% trong 1s & rửa bằng nước cất vô trùng. Sau đó cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mẫu cấy & và cấy vào môi trường dinh dưỡng (Môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng). II.3.2 Tạo thể nhân giống và nhân giống inviro. - Từ 4-8 tuần đỉnh sinh trường được nuôi trong môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ phát triển có màu xanh lục & tạo ra các khối tròn gọi là thể chồi. Tiến hành cắt thể chồi ra thành 4-6 miếng rồi chuyển sang môi trường phát triển chồi. Ở đây các thể chối tiếp tục phát triển thành chồi con nhờ các chất kích thích tạo chồi . II.3.3 Tái sinh cây invitro hoàn chỉnh. - Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuẩn bị đem ra vườn ươm. Các thể chồi sẽ được đưa sang môi trường tạo rễ ( chứa nhiều auxin). Điều kiện nuôi cấy gần như giống với môi trường bên ngoài, giúp cây có thể thích nghi tốt sau khi chuyển ra vườn ươm.Giai đoạn này mất khoảng 4-5 tháng để từ thể chồi → cây con. II.3.4 Chuyển cây con invitro ra vườn ươm. - Cây cao khoảng 4-5cm, lá và bộ rễ phát triển đầy đủ thì có thể chuyển ra vườn ươm được. Cây con được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và đặc trong chậu có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp .. để cây có thể thích nghi từ từ. Sau khoảng 2 tuần cây đã quen với điều kiện bên ngoài lúc đó có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Giai đoạn này cây thường bị chết rất nhiều do sự khác biệt giữa môi trường nhân tạo và tự nhiên. Để hạn chế cần phải giữ ẩm tốt cho cây có thể phun sương nhiều lần hoặc tưới thuốc ra rễ giúp cây mau thích nghi hơn. II.4 Các yếu tố ảnh hường đến môi trường nuôi cấy. II.4.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy. Mẫu cấy có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự sinh truởng và phát triển in-vitro. + Kiểu di truyền: Nếu một loài dễ tái sinh trong tự nhiên thì sẽ dễ tái sinh trong in-vitro.Những cây hai lá mầm tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm. + Tuổi của cây. + Tuổi của mô và cơ quan: Những mô non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng. Các mẫu lấy từ các cuống lá còn non sẽ tái sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm. + Tình trạng sinh lý: Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh trưởng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông khó nuôi cấy in-vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua giai đoạn này. +Vị trí của mẫu cấy trên cây:Những chồi được tách từ vị trí thấp trên cây phát triển trong môi trường in-vitro tốt hơn và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn. Tuy nhiên những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ những phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in-vitro giống nhau. + Kích thướt mẫu cấy: Mẫu cấy có kích thướt lớn dễ tái sinh và phát triển hơn. Đối với những phần mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây. + Vết thương: Sự tổn thương trên mặt mẫu cấy đóng vai trò quyan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy. Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự thấp thu chất dinh dưỡng và các chất điều hòa đồng ethylene được tạo ra nhiều hơn. II.4.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy. - Thành phần môi trường có vai trò quan trọng đối với sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thựuc vật. Môi trường nuôi cấy sẽ thay đổi tuỳ theo từng giai đoạn phát triển của mẫu cấy. Tuy nhiên môi trường cần phải có đủ 5 thành phần: Khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường và các chất điều hòa tăng trưởng 4.2.1 Khoáng đa lượng: Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trong tự nhiên. Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính: N P L. + Đạm (N) giữ vai trò tạo lập Protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân lá rễ phát triển, quang tổng hợp mạnh. Thiếu đạm cây màu nhợt nhạt, ốm yếu, cây sinh trưởng kém, cần cổi… Để cung cấp N ta dùng những chất sau: . CO(NH2)2 : Hay urê (46% N) . (NH4)2S04: Sulfat Ammonium tức SA (22% N). . KNO3 : Kali Nitrat (14% N). . NH4NO3 : Nitrat Ammonium (30% N). . Na NO3: Natri Nitrat .Ca(NO3)2 : Calci nitrat. +Lân (P) : Giúp cây hô hấp và qunag hợp, tạo sự hấp thu đạm được dễ dàng. Lân giúp cây ra hoa , ra rễ, kích thích ra hoa, làm hoa bền ít rụng… Các chất có thể cung cấp Lân: . Super Lân (20% P2O5):) . (NH4)2HP04: Diamonium Phosphat DAP (54% P2O5) . (NH4)3 HPO4.3H20: Trianium Phosphat . KH2 PO4: Phosphat kali + Kali (K) : Tạo các bó mạch trong cây, giúp cây cứng cáp, chắc , đứng thẳng, giúp cây ra hoa… Các chất cung cấp K như: . KCl: Clorua kali (60% K2O). . K2SO4: Sulfat kali (48% K2O). . KNO3: Kali natri (44% K2O). . KH2PO4: Phosphat (40% K2O). 4.2.2 Nhóm bán đa lượng. Gồm các nguyên tố: Ca, Mg, S. + Calcium (Ca): tạo vách tế bào, giúp cây cứng chắc, là dầy…Các chất cung cấp Ca như: CaCl2 (Calci Clorua), Ca(NO3)2 (Calci nitrat). Đối với các chất chứa Ca không nên hòa tan với các chất khác vì dễ gây kết tủa, cây không hấp thu hiệu quả. + Magnesium (Mg) Thành phần tạo nên diệp lục tố cho cây, làl lá cây phát triển, lá xanh. Có thể dùng MgSO4 hay MgHPO4 để cung cấp Mg cho cây. + Sulfur (S) Là thành phần của tế bào chấtm giúp cây tăng trưởng. Thiếu S cây cằn cổi lá nhỏ. Thưùơng S có chứa sẵn trong các chất có gốc SO4 như: K2SO4, MgSO4, MgHP04… Nhóm vi lượng. Nhóm này rất cần thiết cho lan mặc dù lan cần rất ít (không qú 5mg/lít). Một số nguyên tốp vi lượng như: Bo, Zn, Cu, Mo,Mn, Fe… + Sắt (Fe): Dóng vai trò tạo dịp tố, gíup cây quang tổng hợp tốt, thiếu sắt làm lá cây có màu xanh lợt, đầu rễ kém phát triển có thể dùng FeADTA để cung cấp Fe cho cây. + Đồng (Cu) Thiếu đồng dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều.Dùng CuSO4 để cung cấp cho cây. + Kẽm(Zn): Thiếu Zn làm thân ngắn lại, lá mọc chụm ở đầu. Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho cây. + Mangan(Mn) : Thiếu mangan lá vàng nhạt, ở lá già thường có vhấm vàng. Dùng MnSO4 để cung cấp Mn cho cây. + Molyden: (Mo) Điều hòa tăng trưởng của cây. Có thể dùng Na2Mo04 (Molypdat Natri) để cungcấp Mo cho cây. Carbon và nguồn năng lượng. Trong nhân giống invitro nguồn carbon thường dùng là glucose và sucrose. Sucrose là nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy. Nồng độ sucrose có thể ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất trong tế bào nuôi cấy. Vitamin: Các vitamin rất cần thiết cho sự phát triển và tăng trưởng của thực vật. vitamin có thể súc tác các quá trình biến dữỡng khác nhau. Các vitamin thuờng dùng trong nuôi cấy mô là: Thiamine(B1) acid nicotinic, Pyridoxine (B6) và Myo- inositol. B5, B12. Trong đó B1 được dùng rất phổ biến trong việc tạo chồi, rễ, các cây mới trồng tưới bổ sunug B1 rất tốt. 4.2.6 Các chất điều hòa sinh trưởng: Chủ yếu có 5 chất quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin(GA3). Cytokinin, Abscisic acid và ethylen. + Auxin tự nhiên là một hợp chất đơn giản: indol-3- acetic acid (IAA). Auxin kết hợp cới cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân ngọn chồi từ nhu mô. + Cytokinin là loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, tỉ lệ Auxin/Cytokinin (A/C) cao giúp tạo tạo rễ, A/C thấp tạo chồi. Ngoài 5 hợp chất trên có thể bổ sung các chất hưu cơ như:( amino acid, EDTA.) + Các chất hữu cơ không xác định: Protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiếc nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối nước cam… + Than hoạt tính: Có tác dụng khử độc . + Yếu tố làm đặc môi trường: Thường sử dụng là agar  Phần III Kết luận: - Như vậy từ một mô hoa lan nuôi cấy để tạo ra cây con từ 3-4 lá có thể chuyển ra vườn trồng mất khoảng 8-11 tháng. Với việc nhân giống vô tính trên sẽ đảm bảo tạo ra cây con có đặc tính hoàn toàn giống cây cha mẹ, cây không bị nhiễm bệnh, đặc biệt là nhân nhanh một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn. Tuy nhiên việc nhân giống này cũng đòi hỏi một số yêu cầu: thực hiện nghiêm túc & tỉ mĩ theo đúng quy trình, phải có phòng thí nghiệm, trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt là điều kiện vô trùng cần phải đảm bảo nghiêm ngặt. Phương pháp này mặc dù còn nhiều hạn chế so với các phương pháp khác như: hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời… nhưng đối với đất nước có ngành công nghệ sinh học mới mẻ như chúng ta thì đó cũng là một hướng phát triển cần phải được đầu tư và phát triển thêm. Tài Liệu tham khảo: Kỹ thuât trồng và kinh doanh phong lan, Huỳng Căn Thới. 1996. www.sinhhocvietnam.com.vn. www.aquabird.com.vn www.kyhoadithao.com www.rauhoaquavn.vn