Đề tài Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp

Sở GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HƯNG YấN TRƯỜNG THPT TIấN LỮ Sáng kiến kinh nghiệm Năm học: 2012 – 2013 Mụn: Sinh học Đề tài: “ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” Người thực hiện: đỗ ngọc thái Tiên Lữ, tháng 4 năm 2013 Mục lục Trang Phần A: Đặt vấn đề I. Lí do chọn đề tài 2 II. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2 III. ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3 IV. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3 V. Phương pháp nghiên cứu 3 Phần B: Nội dung nghiên cứu I. Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô thực vật. 4 II. Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn. 2.1. Các yếu ảnh hưởng. 5 2.2. Tái sinh cây. 6 2.3. ứng dụng. 7 III. Chọn dòng tế bào thực vật. 3.1. Cơ sở khoa học. 8 3.2. Vật liệu và phương pháp. 9 3.3 chọn dòng chịu bệnh. 11 3.4. Chọn dòng chống chịu các stress của môi trường. 14 3.5. Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao. 17 IV. Lai tế bào thực vật. 20 V. Chuyển gen ở thực vật. 5.1. Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật. 26 5.2. Các phương pháp chuyển gen. 27 5.2.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. 27 5.2.2. Chuyển gen nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens và virus. 28 5.2.3. Phương pháp chuyển gen trực tiếp. 28 5.2.4. Phương pháp chuyển gen nhờ sung gắn gen. 29 5.2.5. Phương pháp chuyển gen bằng vi tiêm 29 5.3. ứng dụng kĩ thuật chuyển gen trong nông nghiệp 31 VI. Thành tựu công nghệ sinh học thực vật ở Việt Nam 31 VII. Kết quả nghiên cứu và thực nghiệm sư phạm 33 VIII. Điều kiện áp dụng đề tài Phần C: Kết luận và kiến nghị I. Kết luận 34 II. Kiến nghị 34 III. Những hạn chế và hướng phát triển tiếp của đề tài 35 Tài liệu tham khảo 36 Phần A: đặt vấn đề I. Lí do chọn đề tài Thế kỉ XXI là thế kỉ của công nghệ sinh học, nó đang trở thành ngành khoa học mũi nhọn và then chốt của nhiều nước. Sự phát triển của công nghệ sinh học là một trong những tiêu chí hàng đầu để đánh giá trình độ phát triển của một nước nào đó. Chính vì vậy, các nước đã tập trung rất ngân sách của và nhân lực cho sự phát triển của ngành công nghệ sinh học (biotechnology). Với tầm quan trọng như vậy nên ở tất cả các Trường Đại học: Nông nghiệp, Lâm nghiệp, Thủy Sản, Y học và Sự phạm đều có bộ môn hay khoa công nghệ sinh học. Trong chương trình môn Sinh học và Công nghệ Trung học phổ thông có khoảng từ 5 -10 bài học có liên quan đến công nghệ sinh học. Trong các đề thi tuyển sinh đại học có khoảng 2 - 5 câu hỏi trắc nghiệm có liên quan đến công nghệ sinh học. Điều này đòi hỏi các đồng chí giáo viên và các em học sinh phải có những hiểu biết sâu sắc và toàn diện về công nghệ sinh học. Tuy nhiên, do đây là nội dung mới nên các đồng chí giáo viên và các em học còn nhiều bỡ ngỡ. Xuất phát từ những lí do trên, nên khi tiến hành nghiên cứu viết sáng kiến kinh nghiệm, tôi đã mạnh dạn chọn đề tài: “ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” II. Mục đích và yêu cầu của đề tài 1- Mục đích : Xây dựng và hoàn thiện chuyên đề “ ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” và trở thành nguồn tư liệu quý cho giáo viên và học sinh. 2- Yêu cầu : Trình bày được ứng dụng của công nghệ sinh học thực vật trong các lĩnh vực sau: - Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô thực vật - Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn - Chọn dòng tế bào thực vật - Lai tế bào thực vật - Chuyển gen thực vật - Thành tựu công nghệ sinh học thực vật ở Việt Nam III. ý nghĩa thực tiễn của đề tài Sự hoàn thiện đề tài này sẽ trở thành nguồn tư liệu phong phú giúp cho mỗi giáo viên và học sinh có cái nhìn toàn diện và sâu sắc về tầm quan trọng của ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp. Từ nhận thức đến hành động, biến mỗi giáo viên và học sinh trở thành những kĩ thuật viên, tuyên truyền viên tích cực, cổ vũ cho sự phát triển của ngành công nghệ sinh học nước nhà. Ngoài ra, đề tài này còn giúp giáo viên và học sinh dạy - học tốt môn Sinh học nói chung và chuyên đề ứng dụng công nghệ sinh học nói riêng. Qua đó nâng cao tỉ lệ thi đỗ vào chuyên ngành khối B của các trường Đại học, Cao đẳng và Trung cấp chuyên nghiệp. IV. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Thực vật. Phạm vi nghiên cứu: Công nghệ sinh học là môn khoa học đa ngành và đa lĩnh vực. Tuy nhiên, với đề tài này tôi chỉ tập trung nghiên cứu ứng dụng của 5 lĩnh vực: nuôi cấy mô, tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn, chọn dòng tế bào, lai tế bào và kĩ thuật chuyển gen ở thực vật. Vì đây là những kiến thức có liên quan trực tiếp đến vần đề dạy - học và ôn thi đại học và cao đẳng của học sinh Trung học phổ thông. V. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu các tài liệu được lấy từ các nguồn thông tin như giáo trình đại học và cao học, các chuyên đề chuyên sâu dành cho bồi dưỡng giáo viên các trường chuyên, internet, .... Rồi tiến hành tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài. Phương pháp trao đổi kinh nghiệm, học hỏi các đồng nghiệp và các chuyên gia. Phương pháp tham gia các hội thảo về chuyên đề “ Công nghệ sinh học” Phương pháp tham quan các cơ sở Công nghệ sinh học : Viện rau quả trung ương, Viện công nghệ sinh học, Khoa công nghệ sinh học, ... Đặc biệt là trực tiếp làm thí nghiệm: trong thời gian học cao học, tôi đã trực tiếp tham gia đề tài cấp nhà nước “Chuyển gen sinh auxin và gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc thụ bầu nhụy vào cây cam Vinh và quýt Đường canh“. Phương pháp đánh giá qua thực tiễn sư phạm. Phần B. Nội dung nghiên cứu I. VI NHâN GIốNG bằng nuôi cấy mô thực vật Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô hay còn gọi là vi nhân giống in vitro. Quá trình nhân giống này phải trải qua nhiều công đoạn: Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, nó không những quyết định sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân tiếp theo. Các công trình của D.Amato (1977) cho thấy chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới bảo đảm sự ổn định về di truyền. Tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt để nhân. Các chồi nhân ban đầu thường được tạo từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên môi trường thạch chứa các muối khoáng, cabonhydrat, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng (xitokinin và auxin). Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây định nhân sau đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy ở môi trường phù hợp có xitokinin. Sự phát triển nhanh của mô nuôi cấy phụ thuộc vào ánh sáng và nhiệt độ. Chồi được nhân lên sau 3 đến 4 tuần. Các chồi hình thành lại được tách ra chuyển sang môi trường mới và qui trình cứ thế được lặp lại. Để tạo rễ thì chồi nhân phải chuyển sang môi trường có auxin. Đây là phương pháp nhân cho hệ số nhân thấp hơn phương pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo hoặc phôi, nhưng các chồi nhân giữ lại được những đặc điểm của phôi gốc, ít hoặc không bị thay đổi về mặt di truyền. Hiện nay nhờ phát triển những môi trường và hệ thống nhân phù hợp, hệ số nhân đã được tăng lên nhiều (58 – 515 chồi/tháng). Đặc biệt là nhân chồi trong môi trường lỏng có lắc hoặc nhân trong các reactor. Trong một số trường hợp, vi nhân giống có thể thực hiện thông qua việc tạo phôi hoặc tái sinh cây thẳng từ mô sẹo. Phương pháp này cho hệ số nhân cao hơn, nhưng thường kéo theo sự biến dị sôma nên trước khi chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần kiểm tra kỹ những thay đổi về di truyền. Vi nhân giống có những ưu việt sau: - Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất. - Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong 1 m2 nền có thể để được tới 18.000 cây. - Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảm các cây giống sạch bệnh. - Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng 15kg). Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi. Các cây giống giữ ở nhiệt độ 4oC trong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống đến 95%. Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều. Mấy năm gần đây, hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây, ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng được yêu cầu thực tiễn. Một vấn đề hiện nay là giá cây trồng nhân bằng phương pháp vi nhân còn cao (300 - 8000 đ/cây) vì vậy cần phải cải tiến các qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc biệt là cơ giới hóa các khâu nhân hoặc chỉ nhân những giống cây thật quí hiếm và có giá trị kinh tế cao. Trên thực tế cây nhân bằng phương pháp vi nhân bao giờ cũng đắt hơn cây giống từ hạt. Hiện nay nhân giống đã thành công trên nhiều giống cây như lan, hoa cúc, hoa hồng, cẩm chướng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, quýt, thông.... Vi nhân giống ngoài việc ứng dụng để nhân nhanh một số giống cây, còn có thể rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây nguyên chủng tự nhiên có các đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sảnh xuất hạt lai. II. TạO CâY ĐơN BộI bằng nuôi cấy hạt phấn Có nhiều phương pháp tạo cây đơn bội, nhưng từ những năm 60, việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được phát triển. Cây đơn bội có thể nhận bằng nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn trên môi trường thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs, 1977) hoặc môi trường lỏng (Wernicke & cs, 1976). Trong quá trình nuôi cấy, hạt phấn phân chia, tạo mô sẹo hoặc phôi và tiếp theo có thể tạo cây. 2.1. Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phôi và mô sẹo 2.1.1. Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hưởng rất lớn đến hạt phấn nuôi cấy in vitro. Tuổi của cây, sự thay đổi chu kỳ quang cũng như nhiệt độ là những yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến nuôi cấy tạo cây đơn bội. Kết quả nghiên cứu của Dunwell (1976) cho thấy tỉ lệ phôi cao nhận được khi sử dụng những nụ hoa hình thành sớm và cây phát triển ở nhiệt độ thấp hoặc ngắn ngày với cường độ chiếu sáng cao cho tỉ lệ tạo phôi từ hạt phấn cao hơn. ở một số loại cây hạt phấn ở giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi và mô cao, ở một số giống khác thì hạt phấn ở giai đoạn mitos đầu cho hiệu quả tốt hơn. Vấn đề kiểu gen cũng rất quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấn của các cây khoai tây nhị bội tạo từ cây đơn bội sử dụng để nuôi bao phấn có hiệu quả hơn so với bao phấn từ cây bố mẹ. Ngoài ra, xử lí bao phấn ở nhiệt độ thấp (3 - 10oC) cũng gia tăng tỉ lệ tạo mô và phôi từ hạt phấn (Wenzel & cs, 1977). 2.1.2.Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro Thành phần cacbonhydrat trong môi trường hết sức quan trọng, đặc biệt là đường sucrose khi nuôi cấy bao phấn thuốc lá cần từ 2% - 4%. Đối với khoai tây và lúa cần đến 6%, thậm chí 12%. Trong các chất hữu cơ, các axit như glutamic có tác dụng kích thích phát triển phôi ở một số giống cải và thuốc lá, serin đặc biệt cần cho phát triển phôi từ hạt phấn thuốc lá. Các dịch chiết tự nhiên như dịch chiết khoai tây, dịch chiết nấm và một số chất khác như vitamin C, nước dừa có tác dụng tích cực cho tạo phôi, mô sẹo và tái sinh cây trong nuôi cấy bao phấn. Auxin đặc biệt quan trọng cho tạo mô sẹo nhưng lại ức chế tạo phôi. Vì thế trong trường hợp tạo phôi cần tránh sử dụng auxin. Nói chung auxin thường có tác dụng ở giai đoạn nuôi cấy ban đầu. Xytokinin cực kì quan trọng cho phản ứng của hạt phấn nuôi cấy. Trong một số ít trường hợp etylen kích thích tạo mô sẹo. Wilson & cs (1978) cho biết nuôi cấy bao phấn trong môi trường lỏng làm tăng tần số tạo phôi ở thuốc lá và lúa mạch. Bổ sung vào môi trường than hoạt tính có tác dụng loại bỏ các chất ức chế và làm tăng hiệu quả nuôi cấy bao phấn. Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu quả nuôi cấy. Đối với thuốc lá mật độ tối ưu là 105 hạt/ml môi trường. Đối với các cây khác mật độ dao động từ 104 - 105. ánh sáng đối với nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, đối với thuốc lá chỉ cần 300-500 lux. Nhiệt độ bình thường từ 25-28oC là thích hợp đối với nuôi cấy bao phấn và hạt phấn của hầu hết các giống cây. 2.2. Tái sinh cây Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tương đối dễ, thậm chí cây có thể tái sinh ngay trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo phôi. Đối với một số loài cây khác, nhất là cây một lá mầm (lúa, ngô, mì), trên môi trường nuôi cấy ban đầu chứa chất sinh trưởng và đường cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phải chuyển sang môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng. Một số trường hợp phải dùng zeatin và nước dừa mới có thể tái sinh cây. Trong trường hợp tạo cây qua mô sẹo, việc tái sinh cây cũng có thể xảy ra trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng, nhưng thường thì phải chuyển sang môi trường có nồng độ auxin thấp và nồng độ cytokinin. Các cytokinin thường hay dùng là BAP và kinetin. Cho thêm các chất như casein, lactoabumin thủy phân và nước dừa thường làm gia tăng tỉ lệ tái sinh cây nhất là đối với các cây ngũ cốc. Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉ lệ tái sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh. Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốc thường có hiện tượng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%). Wang và cs (1977) thấy rằng tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao. Ngoài ra, cây bạch tạng xuất hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-Ping, 1978). Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhưng ở một số loài cây có cả cây nhị bội và đa bội. Những kết quả nghiên cứu tế bào học cho thấy sự tạo thành các cây nhị bội và đa bội là do kết quả của dung hợp nhân hoặc nhân bản di truyền mà không có sự phân chia nhân xảy ra trong quá trình nuôi cấy. 2.3. ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn Các cây đơn bội từ hạt phấn có ý nghĩa thực tiễn lớn, trước hết là làm nguyên liệu để tạo các dòng thuần. Muốn tạo dòng thuần phải lưỡng bội hóa các cây đơn bội bằng xử lí consixin hoặc thông qua tạo mô sẹo từ các cây đơn bội sau đó tái sinh cây. Như đã nói trên, ở một số loại cây có thể nhận được cây nhị bội ngay trong quá trình nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn, nhưng trong trường hợp này cần kiểm tra sinh hóa và tế bào học kỹ lưỡng. Các dòng thuần có ý nghĩa rất lớn trong cải biến cây trồng. Chúng được sử dụng tạo các cây lai khỏe mạnh từ các cặp lai giữa bố mẹ bất tương hợp ( Chu & cs, 1978) và rút ngắn thời gian tạo hạt lai. Các dòng đơn bội kép đã tạo được ứng dụng trong sản xuất lúa mạch, thuốc lá, cải dầu, lúa... Trong thời gian ngắn khoảng 3 đến 4 năm hai giống thuốc lá cho năng suất cao và chất lượng tuyệt hảo đã được tạo ra bằng phương pháp cấy bao phấn (Hu han & cs, 1978). Nhiều giống lúa mới như Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin & cs, 1976), những giống lúa mì Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) cũng đã được tạo bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn. Ngoài ra các dòng đơn bội kép còn được sử dụng để phát triển quần thể cho việc lập bản đồ phân tử. Trong nghiên cứu, cây đơn bội là đối tượng tốt để nghiên cứu kết hợp đôi giữa các cặp NST, ngoài ra phân tích di truyền trên quần thể cây đơn bội để xác định kiểu di truyền các tính trạng lặn. Các cây đơn bội còn dùng làm nguyên liệu tạo các cây đa bội lệch. Cây đơn bội cũng được dùng trong lai khác loài để rút ngắn thời gian ổn định về NST. Nuôi cấy bao phấn có thể ứng dụng để nghiên cứu và tạo đột biến. Sơ đồ ứng dụng nuôi cấy bao phấn Bao phấn hoặc Giống mới hạt phấn Nuôi cấy bao phấn Cây đơn bội Lưỡng bội hóa Cây lưỡng bội Dòng thuần Dòng siêu chủng III. CHọN DòNG Tế BàO THựC VậT (CDTBTV) 3.1.Cơ sở khoa học. Cơ sở khoa học đầu tiên của CDTBTV là tế bào thực vật mang tính toàn năng. Mỗi loài thực vật có khả năng tái sinh khác nhau. Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật ở đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào đến khi hình thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi về di truyền do ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hòa sinh trưởng. Mặt khác, cũng có các quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và phát triển, những quần thể tế bào này là đối tượng hết sức lí tưởng trong việc sử dụng các chất gây đột biến để thu nhận các đột biến có ý nghĩa. Cũng như cây trồng, trong nuôi cấy mô và tế bào, có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình. Một loại là kết quả của sự thay đổi gen, được gọi là những thay đổi di truyền, còn một loại không liên quan đến thay đổi gen, được gọi là biến đổi ngoài gen. Những thay đổi ngoài gen không di truyền được. Ngoài những vấn đề vừa nêu, trong nuôi cấy mô và tế bào còn gặp một hiện tượng phổ biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bào có thể thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phương pháp chọn lọc nào. Hiện tượng này gọi là hiện tượng phân dòng sôma. Có tác giả gọi các dòng cây tái sinh từ tế bào nuôi cấy là “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây tái sinh từ protoplast là “protoclones” (Sheppard & cs, 1980). Larkin va Scowcroft (1981) đưa ra một định nghĩa có tính chất khái quát hơn “somaclonal variation’ để chỉ tất cả những thay đổi của cây tái sinh từ bất kỳ loại tế bào nuôi cấy nào. 3.2. Vật liệu và phương pháp chọn dòng Chọn vật liệu cho các thí nghiệm CDTBTV là rất quan trọng. Các vật liệu có thể là tế bào cho đến các mô phân hóa. Mỗi loại vật liệu có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Việc chọn vật liệu này hay vật liệu khác còn phụ thuộc vào sự thuần phục của các phương pháp nuôi cấy đối với từng loại cây. Vật liệu thường dùng hơn cả trong CDTBTV là mô sẹo (callus). Mô sẹo được dùng để chọn các dòng chống chịu như chịu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chịu muối (McHughen, 1987; Kavi Kishor, 1988), và chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Nozue và cs, 1987; Hiraoka, 1986). Đối với mô sẹo có thể sử dụng các phương pháp chọn lọc trực tiếp tức là chọn trên môi trường chọn lọc chứa một nồng độ nhất định của chất chọn lọc, các mô và tế bào đột biến có tính chọn lọc hơn hẳn so với quần thể, Một số tác giả khác lại sử dụng phương pháp chọn lọc từng bước tức là khi mô hoặc tế bào sống sót trên một nồng độ nhất định của tác nhân chọn lọc thì lại chuyển sang nồng độ cao hơn. Ngoài ra cũng có thể sử dụng kết hợp cả hai phương pháp. Sự ổn định của mô chọn lọc là khả năng phát triển bình thường liên tục trên môi trường chọn lọc hoặc khi chuyển môi trường chọn lọc và sau một thời gian dài cấy trên môi trường không chọn lọc vẫn mất đi đặc điểm đã được chọn lọc. Sử dụng mô sẹo làm nguyên liệu CDTBTV có ưu điểm là đơn giản nhưng nguyên liệu này có một số nhược điểm là: dễ tạo ra các dạng khảm vì trong mô chọn lọc còn có nhiều tế bào bình thường nên khi tái sinh cây, trong quần thể cây tái sinh có cả những cây mang đặc điểm chọn lọc và những cây vẫn mang đặc điểm giống bố mẹ, thậm chí trong một cây có thể có phần chứa các tế bào chọn lọc, phần khác vẫn chứa các tế bào bình thường. Để khắc phục nhược điểm này có thể giảm kích thước của mô: mô càng nhỏ càng tốt. Trọng lượng mô thường dùng là 100-150 mg, nhưng có thể giảm xuống đến 10-20 mg (Wakaha & Widholin, 1987). Tế bào nuôi cấy dịch lỏng đã được nhiều tác giả sử dụng trong CDTBTV (Kishinami & Widholin, 1986; Watad và cs, 1985). Đối với loại tế bào này các phương pháp chọn lọc trực tiếp và chọn từng bước cũng đã tiến hành có kết quả trên nhiều đối tượng. Sử dụng tế bào dịch lỏng để CDTBTV có ưu điểm là tế bào hoặc cụm nhỏ các tế bào được tiếp xúc đồng đều với tác nhân chọn lọc, nhưng một nhược điểm quan trọng là sau khi chọn lọc khả năng tái sinh cây bị giảm đáng kể và trong nhiều trường hợp có thể mất hẳn. Hầu hết các dòng chọn lọc thông qua hệ thống tế bào dịch lỏng đều không nhận đuợc cây (Dix, 1990). Vì thế hệ thống tế bào dịch lỏng có thể sử dụng để chọn các dòng có khả năng tổng hợp và tích lũy các chất thứ cấp thì phù hợp hơn. Trong trường hợp này thì tế bào dịch lỏng đáp ứng được mục đích nuôi cấy tế bào trên qui mô lớn đặc biệt là việc sử dụng các công nghệ nuôi tế bào thực vật trên qui mô công nghiệp. Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng được nhiều mặt trong CDTBTV. Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất. Từng tế bào được phát triển đồng đều trong môi trường, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và mô sẹo, cuối cùng là các mô sẹo tái sinh thành cây hoàn chỉnh, chính vì thế có thể tránh được hiện tượng khảm. Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs, 1986) và các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs, 1985) đã được chọn lọc nhờ sử dụng hệ thống protoplast. Trước đây việc nuôi cấy và tái sinh cây từ protoplast còn gặp nhiều khó khăn, nhất là tái sinh cây từ protoplast của những loài cây có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệ thống nuôi cấy protoplat trong CDTBTV còn bị hạn chế. Hiện nay hệ thống nuôi cấy protoplast với hiệu quả cao ở nhiều loài cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng như khoai tây, cà chua, ngô, lúa, lúa mì đã được công bố. Vì vậy protoplast sẽ trở thành vật liệu lý tưởng cho CDTBTV. Cần phải nói thêm rằng protoplast còn là đối tượng quan trọng trong cải biến di truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt là dung hợp tế bào và chuyển gen. Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏng và protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mô phân hóa hoặc mô tách rời làm nguyên liệu CDTBTV. Một trong những mô phân hóa được sử dụng là phôi từ hạt (Kueh & Bright, 1981) hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984). Fluhr & cs (1985) đã chọn được dòng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh. McCabe & cs (1989) cũng nhận được dòng kháng thuốc khi xử lí mảnh lá. Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp chọn lọc in vitro đối với mô sẹo, tế bào dịch lỏng, prptoplast và mô phân hóa có thể kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến để làm tăng dần số đột biến và các kiểu đột biến. Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau khi tách bằng tia cực tím (UV) hoặc N -methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG). Phương pháp tương tự cũng được một số tác giả khác tiến hành có hiệu quả khi sử dụng. N -ethyl-N-Nitrosourea (Cseplo & cs, 1985), MNNG, UV, và tia X (Maliga & cs, 1981). Ngoài ra có thể xử lí mẫu vật bằng các chất gây đột biến trước khi đưa vào nuôi cấy và chọn lọc. 3.3. Chọn dòng chịu bệnh Mặc dù phương pháp truyền thống có thể tạo được các dòng hoặc giống chịu bệnh nhưng trong một vài trường hợp không thể chọn được các dòng chịu bệnh bằng những phương pháp này hoặc chọn được nhưng tốn nhiều công sức và thời gian. Việc gây nhiễm bệnh nhân tạo cho một số lượng lớn cây để tạo chọn giống chịu bệnh là cả một vấn đề, ngoài ra gây nhiễm trong nhà kính nhiều khi cũng không thành công. Không những thế bằng phương pháp truyền thống việc chọn các đột biến đơn gen hoặc đa gen kháng cùng một loại bệnh gặp rất nhiều hạn chế: thứ nhất là phải chọn bố mẹ phù hợp, thứ hai là lai ngược mất rất nhiều thời gian, thứ ba là không chuyển được các gen lặn hoặc nhiều gen một lúc. Đặc biệt đối với các loài cây chỉ nhân vô tính thì chuyển gen không thể thực hiện được bằng lai tạo. Đột biến thực nghiệm có thể tạo được giống cây chịu bệnh nhưng tần số xuất hiện các đột biến đơn gen rất thấp (10-4 - 10-6), ngoài ra tỉ lệ khảm ở các cây đột biến tương đối cao. Từ 1970 đã có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật CDTBTV in vitro có thể khắc phục được nhiều vấn đề trong chọn dòng chịu bệnh như: qui mô thí nghiệm, thời gian chọn lọc, khống chế được điều kiện gây nhiễm. Ngoài ra có thể nhận được các đột biến đơn gen và đột biến lặn. Nếu tần số đột biến đơn gen trong trường hợp đột biến thực nghiệm là 10-4 - 10-6 thì ở quần thể cây tái sinh (Ro) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5% (Larkin & Scowcroft, 1981). Nếu kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy in vitro có thể làm tăng tần số đột biến hơn nữa ( Maliga & cs, 1981). Tuy nhiên chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cần nghiên cứu giải quyết như vấn đề tương hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tượng lây nhiễm ở đây là mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tác nhân gây bệnh không nhận ra chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh). Để chọn dòng chịu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độc tố gây bệnh (ĐTGB). Phần lớn tác nhân gây bệnh đã được sử dụng là virus và đối tượng được lây nhiễm là protoplast. Vấn đề then chốt là phải tạo được quần thể tế bào bị nhiễm đồng đều và phân biệt được tế bào chịu bệnh với tế bào không bị nhiễm vì cả hai đều có khả năng phát triển trên cùng một điều kiện nuôi cấy. Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard (1975), Murakishi và Carlson (1982) đã tách protoplast từ cây bị lây nhiễm liên tục, sau đó nuôi vấy và chọn lọc. Murakishi và Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum) có màu vàng lây nhiễm cây thuốc lá đơn đơ