Nuôi cấy thông đỏ để thu nhận taxol

Lời giới thiệu Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất hóa học khác nhau rất có giá trị, chẳng hạn các chất dùng làm dược liệu, các chất tạo mùi, các chất dùng làm gia vị, các sắc tố và các hóa chất dùng trong nông nghiệp. Những sản phẩm này, được biết như là các chất trao đổi thứ cấp (secondary metabolites), thường được sản xuất với một lượng rất nhỏ (dạng vết) trong thực vật và không có chức năng trao đổi chất rõ ràng1. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường chung quanh, là sự thích nghi với stress của môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiều hợp chất trao đổi thứ cấp (thường gọi là các chất thứ cấp) vẫn còn khó tổng hợp hoặc có thể tổng hợp được nhưng chi phí rất đắt. Chẳng hạn, một số hỗn hợp phức tạp như tinh dầu hoa hồng là không thể tổng hợp hóa học được. Để sản xuất các sản phẩm thứ cấp từ thực vật, các mô thực vật ngoại sinh (chẳng hạn từ cây hoàn chỉnh) có thể được sử dụng để nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (cell suspension culture) trong điều kiện vô trùng. Cơ sở khoa học của kỹ thuật này là dựa trên tính toàn thể hóa sinh (biochemical totipotency) duy nhất của tế bào thực vật. Nuôi cấy tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để sản xuất các chất thứ cấp có một số ưu điểm sau: - Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý. Không cần thiết để vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô. - Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản. - Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh. Mục lục: Phần 1: Tổng quan về thông đỏ 1.1. Phân loại họ thông đỏ 1.2. Đặc điểm 1.3. Phân bố 1.4. Một số giá trị từ cây thông đỏ Phần 2: Nuôi cấy thông đỏ để thu nhận taxol 2.1. Một số thông tin về hoạt chất từ cây thông đỏ (taxus) 2.2. Sản xuất dược chất taxol từ thông đỏ bằng con đường sinh học 2.3. Kỹ thuật nuôi cấy thông đỏ để sản xuất taxol: Phần 3: Kết luận Tài liệu tham khảo Phần 1: Tổng quan về thông đỏ: 1.1. Phân loại họ thông đỏ: Cây thông đỏ ( Taxus wallichiana zucc ) thuộc họ Thanh Tùng ( Taxaceae ) Phân loại khoa học: Giới (regnum): Plantae Ngành (divisio): Pinophyta Lớp (class): Pinopsida Bộ (ordo): Pinales Họ (familia): Taxaceae Các chi: gồm 2 nhóm Taxaceae: Austrotaxus - thanh tùng New CaledoniaPseudotaxus - thông trắng (bạch đậu sam)Taxus - thanh tùng (thông đỏ, hồng đậu sam) Cephalotaxaceae Amentotaxus - dẻ tùng, sam bông Cephalotaxus - đỉnh tùng (phỉ ba mũi) Torreya - phỉ Hình 1:Thông đỏ (TAXUS WALLICHIANA ZUCC) Các khác biệt giữa Taxaceae (nghĩa hẹp) và Cephalotaxaceae như bảng dưới đây: Họ Taxaceae Cephalotaxaceae Áo hạt Bao phủ một phần hạt Bao phủ toàn bộ hạt Thời gian phát triển 6-8 tháng 18-20 tháng Độ dài hạt trưởng thành 5-8 mm * 12-40 mm 2. Đặc điểm: Họ Thông Đỏ hay họ Thanh Tùng được định nghĩa theo 2 cách: - Nghĩa hẹp (sensu stricto): là một họ của 3 chi và khoảng 7 tới 12 loài thực vật quả nón. - Nghĩa rộng (sensu lato): là họ của 6 chi và khoảng 30 loài. Họ này chủ yếu là các loài cây bụi hay cây thân gỗ nhỏ nhiều cành. Lá của chúng thường xanh, sắp xếp theo hình xoắn ốc, thường vặn xoắn tại gốc lá để xuất hiện theo kiểu 2 hàng. Các lá có dạng thẳng hay hình mũi mác, với dải khí khổng màu lục nhạt hay trắng ở mặt dưới. Các loài phần lớn là đơn tính khác gốc, ít khi đơn tính cùng gốc. Các nón đực dài khoảng 2-5 mm, tung phấn ra vào đầu mùa xuân. Các nón cái bị suy giảm mạnh, chỉ có một lá noãn và một hạt. Khi hạt chín, lá noãn phát triển thành áo hạt nhiều thịt, bao phủ một phần của hạt. Áo hạt khi chín có màu sáng, mềm, nhiều nước và ngọt, chúng bị một số loài chim ăn và nhờ đó mà hạt được phát tán khi chim đánh rơi chúng. 1.3. Phân bố: Thông đỏ là loài cây rừng rất quý, có giá trị kinh tế rất cao. Cây thong đỏ phân bố hẹp ở các nước Châu Á như: Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar, Philippines, Indonesia, Nepal, Afghanistan… Ở Việt Nam, vào năm 1995, Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia khảo sát tại vùng Pà Cò, Mai Châu, Hòa Bình đã gặp 5 cây thông đỏ T. chinensis (còn gọi là thông đá, cây tra) bên trái dòng núi đá vôi. Riêng ở Lâm Đồng, các cán bộ của Trung tâm Nghiên cứu Lâm sinh Lâm Đồng đã phát hiện một loài thông đỏ Himalaya (T. Wallichiana Zucc) có rải rác nhiều nơi, trên độ cao khoảng 1.500m. Một vài địa điểm có thông đỏ như: khu vực giáp ranh Xuân Thọ, Xuân Trường cách Đà Lạt 17 km, còn 2 cây thông đỏ, một lớn và một nhỏ. Cây lớn có ba thân, đường kính gốc đạt 115cm, ba thân có đường kính tương ứng là 57cm, 41cm và 15cm. Chiều cao cây khoảng 30m. Cây nhỏ có đường kính 33cm, cao 15m, cả hai cây đều mọc bên khe núi.Cành của các cây trên đã được thu thập và giâm hom tại Trung tâm Lâm sinh Lâm Đồng và đã cho nhiều cây hom. Các cây hom này sẽ được đưa về trồng tại Trạm Mang Linh cho phù hợp với nhu cầu sinh thái của loài. Hiện nay, do nạn phá rừng bừa bãi nên quần thể thông đỏ hiện chỉ còn đếm được ở con số hàng trăm cá thể. Mặt khác, vì đặc tính tái sinh hẹp và thế hệ trung gian hầu như không có nên nguy cơ diệt vong của loài cây rừng thông đỏ rất cao. 1.4. Một số giá trị từ cây thông đỏ: Thông đỏ là nguồn dược liệu rất quý trong y học. Từ lâu, trong dân gian đã dùng lá của loài cây này để trị hen suyễn, viêm phế quản, nấc, tiêu hoá...; cành và vỏ dùng trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc của thân non dùng trị bệnh đau đầu... Quả cây thông đỏ Đặc biệt là vào năm 1994, một số nhà khoa học trên thế giới công: Từ cây thông đỏ có thể tìm thấy các hoạt chất để chữa trị bệnh ung thư. Cụ thể, Taxol chiết xuất từ vỏ các loài: T. brevifolia, T. cuspidata, T. yunnanensis, T. baccata và T. wallichiana,… đều có chất lượng và hiệu suất cao, được dùng để "chữa trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư đầu, cổ và có triển vọng xử lý hắc tố (melanomas)...", khoảng 1 kg Taxol/ 9000 kg vỏ của T.brevifolia, còn các loài khác cho hiệu suất nhỏ hơn. Đặc biệt hàm lượng rất biến động theo điều kiện sinh thái môi trường. Hiện tại trong hoá trị ung thư, hai loại thuốc trị bệnh ung thư tiền liệt tuyến và ung thư vú có hai dược phẩm sử dụng nhiều nhất và hiệu quả nhất là Taxol và Taxotere. Thuốc Taxol dựơc bào chế từ chất Paclitaxel và thuốc Taxotere dược bào chế từ chất Docetaxel. Hai dược chất trên đều có chung nguồn gốc và dược liệu, chiết xuất từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Thông thường 1 kg lá thông đỏ chiết xuất được 20 mg Taxol và giá 1 mg Taxol trên thị trường thế giới hiện nay là 4,87 USD. Ví dụ: Để có một liều thuốc trị bệnh ung thư, người ta cần khoảng 1kg taxol và để có 1kg taxol, cần không dưới 7.000kg vỏ thông đỏ. Nghĩa là để có một liều thuốc trị bệnh ung thư được bào chế, chúng ta phải "hy sinh" khoảng sáu cây thông đỏ trưởng thành. Như vậy, toàn bộ rừng thông đỏ của Việt Nam nếu được dùng làm nguyên liệu cũng chỉ đủ để điều chế trên 10 liều thuốc chữa trị ung thư. Phần 2: Nuôi cấy thông đỏ để thu nhận taxol: 2.1. Một số thông tin về hoạt chất từ cây thông đỏ (taxus): Ở nước ta chưa có nghiên cứu sâu về lĩnh vực này, song nghiên cứu phát triển bảo tồn nguồn gen các loài Taxus đã được xúc tiến khoảng 10 năm qua, trong đó loài thông Taxus wallichiana được nhân giống khá dễ dàng bằng phương pháp giâm cành cổ điển ở Đà Lạt, và gần đây là phương pháp nhân In vitro. Đây là những kết quả đáng khích lệ, song trên thực tế chúng ta còn cách rất xa các định hướng nghiên cứu, triển khai của các nước trong nhóm đối tượng này, vì chúng ta do thiếu thông tin nên tiếp cận quá chậm so với tiến trình trên thế giới. Năm 1999,GS. Wickremesinhe từ Hoa Kỳ sang Việt Nam diễn giảng về Thông đỏ Taxus spp. và nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất từ Taxol, tại Đà Lạt. (Wickremesinhe đã trình luận án Ph.D. tại Hoa Kỳ về nuôi cấy In vitro các loài thông đỏ vào năm 1992, tại Đại học Bang Pennsylvania (“Callus and cell suspension cultures of Taxus as a source of taxol and related taxanes”). Tương tự, có các nghiên cứu nuôi cấy khá công phu các loài Taxus của Flores & Sgrignoli (1991), Christen et al. (1991), Gibson et al. (1993), Wann & Goldner (1994), Ewald et al. (1995), Ketchum & Gibson (1995),…Cũng khoảng đầu thập niên 90 có nữ tiến sĩ Paula P. Chee ở Hãng Dược & Upjhon, Kalamazoo - Hoa Kỳ nghiên cứu rất sâu về nuôi cấy In vitro loài T. brevifolia và tái sinh cây thành công từ phôi soma (1994, 1995, 1996) (“Plant regeneration from somatic embryos of Taxus brevifolia”).Các dẫn xuất taxane đã được phát hiện ở T. wallichiana từ đầu thập niên 80 (McLaughlin et al., J. nat. Prod. 44: 312- 319,1981). Chưa thấy có dẫn liệu phân tích T.wallichiana ở Việt Nam. Các nhà nghiên cứu Trung Quốc cũng xác định được Taxol và baccatin từ T. yunnanensis, một loài thông đỏ đặc hữu vùng Vân Nam (Fang et al., 1995). Vấn đề chuyển hóa và tổng hợp các dẫn chất mới có hoạt tính cao từ Taxol các loài Taxus đã được xúc tiến rất sớm. Tổng hợp toàn bộ Taxol đã được nhiều phòng thí nghiệm đổ công sức làm và hầu hết đạt kết quả, trong đó nhóm Nicolaou et al. thực hiện và công bố trên tạp chí Nature 1994, 367; 630- 634; Holton et al. (1994); Cowden & Paterson (Nature 1997, 387),… Đến mức TS.F. Flam đã viết một bài thú vị trên Tạp chí Science (số 263, trang 911: “Race to synthesize taxol ends in a tie”). Trong đó việc tổng hợp nên dẫn chất Eleutherobin, Sarcodictyin A và một số đồng phân có hoạt tính mạnh từ Taxol là một thành công lớn, mà TS. Andrew Holmes ở Đại học Cambridge - Anh Quốc tường trình trên Nature (390: 560 - 561, 12/1997) rất lý thú để tham khảo, vì phần cuối bài viết ông nêu lên Eleutherobin có tác dụng như Taxol, song lại khá phổ biến ở loài San hô mềm Eleutherobia sp.Khả năng chiết tách và hiệu suất chiết Taxol, baccatin,... từ các loài thông đỏ ở Việt Nam chưa rõ, song việc có những nhà nghiên cứu trẻ tiếp tục đi vào lĩnh vực này thật đáng khích lệ, trước hết là để góp phần bảo tồn nguồn tài nguyên gen thực vật quý hiếm thuộc chi Taxus của Việt Nam. 2.2. Sản xuất dược chất taxol từ thông đỏ bằng con đường sinh học: Để sản xuất các hợp chất thứ cấp taxol, trước đây chỉ có thể tổng hợp bằng con đường bán tổng hợp hữu cơ thì nay có thể được sản xuất bằng một phương pháp rẽ tiền và không hại môi trường bằng các enzyme trong các cây thông đỏ Thái Bình Dương (Pacific yew). Hình 2:Công thức hoá học của Taxol Sử dụng các kỹ thuật di truyền ở vi khuẩn để sản xuất Taxol theo con đường tổng hợp sinh học sẽ loại bỏ các bước mà bắt buộc phải che chắn các nhóm hoạt tính trong quá trình tách chiết, kiểm tra tính lập thể, vùng hoạt tính đối với phương pháp tổng hợp ngày nay. Các chất trung gian cuối cùng đánh giá có hệ thống hoạt tính của của năm loại enzyme acyltransferase trong con đường chuyển hoá Taxol (Theo GS. Kevin Walker, Đại học Michigan). Trong đó, enzyme acyltransferase có thể chuyển các nhóm acyl được tổng hợp bằng hoá học thành các nhóm hydroxyl trên tiền chất tự nhiên của Taxol, các tiền chất hoá học được tạo thành phải được biến đổi hiệu qủa để có thể làm nguyên liệu sản xuất thuốc. Ngoài ra, các kỹ thuật di truyền có thể sản xuất các enzyme acyltransferase mong muốn có khả năng chuyển hoá các chất trung gian cao cấp thành baccatin III, các sản phẩm trung gian tự nhiên ở giai đoạn cuối trong con đường chuyển hoá Taxol. Cũng theo Walker, việc chuyển các gene acyltransferase vào vi khuẩn để chúng có khả năng tạo baccatin III và biến đổi baccatin III nhanh chóng, hiệu quả và rẽ, trong một nền hoá học sạch, tuy nhiên việc này cũng rất khó vì tổng hợp Taxol đòi hỏi khoảng hơn 19 gene để có thể tạo vòng ba và thực hiện 8 bước biến đổi oxyhoá, 5 bước acyl hoá và 11 bước tạo trung tâm lập thể. Bên cạnh đó, có thể sử dụng kỹ thuật vi sinh để các sản xuất taxol một các hoàn hảo khi dựa vào một mô hình khoảng 10 gene bao gồm các yếu tố kiểm soát, từ nhiều nguồn khác nhau, đã được tập hợp lại trong vi khuẩn để sản xuất thuốc chống sốt rét arteminisin. 2.3. Kỹ thuật nuôi cấy thông đỏ để sản xuất taxol: 2.3.1. Sơ đồ nuôi cấy: Mẫu thực vật Xử lý mẫu thực vật Nuôi cấy tạo thành mô sẹo Nuôi cấy trong môi trường lỏng trong các bình thủy tinh có dung tích nhỏ, lắc liên tục Nuôi cấy trong các thiết bị lên men có dung tích lớn, khuấy đảo liên tục Ly tâm hoặc lọc Dịch lọc được xử lý để Bã thu nhận sản phẩm 2.3.2. Thuyết minh quy trình nuôi cấy: - Mẫu nuôi cấy: cây thông đỏ đầu dòng được giâm cành trong bầu đất với nhiều độ khác nhau, có thể lấy phần ngọn, lá… mẫu dùng để nuôi cấy phải có những tính chất sau: (1) Mẫu tế bào phải được lấy từ cây biết chắc chắn có khả năng sinh tổng hợp chất cần quan tâm. (2) Mẫu tế bào phải được lấy từ cơ quan (hay bộ phận) trên cây nói trên và ở bộ phận này, hàm lượng các chất yêu cầu có khả năng được tổng hợp hay chuyển hoá cao nhất. (3) Mẫu tế bào phải sạch bệnh và đang trong giai đoạn phát triển mạnh nhất. Nuối cấy tế bào thực vật Khi chọn mẫu để tiến hành nuôi cấy, cần tiến hành các quá trình xử lý như trong vi nhân giống,giâm hom… - Khi mẫu cấy tạo thành mô sẹo, cấy mô sẹo này vào trong môi trường lỏng dùng để nuôi cấy tế bào đơn. Môi trường nuôi cấy ở đây là: + Khoáng MS (Murashige-Skoog) + Ngoài ra còn bổ sung thêm: nước dừa; 2,4 – D hoặc các loại auxin khác; bột chiết nấm men, có thể bổ sung saccharose… - Đầu tiên, mô sẹo được nuôi cấy trong các bình tam giác thể tích 200ml có chứa 20ml môi trường, và đặt trên máy lắc có tốc độ 90 – 100 vong/phút. Nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC, với ánh sáng 3000 lux. Cứ khoảng 2 – 3 ngày lấy mẫu ra kiểm tra bằng cách đếm dưới kính hiển vi, xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào - Sau 1 – 2 tuần, trong bình nuôi cấy sẽ tạo huyền phù tế bào: + Tế bào có khả năng sinh phôi. + Tế bào không có khả năng sinh phôi. - Sau 8 ngày sẽ thu được sinh khối, chuyển toàn bộ sinh khối này sang quá trình nuôi kế tiếp. Dung tích mỗi lần nuôi sau nhiều hơn lần nuôi trước khoảng 10 – 15 lần. Cứ như vậy, nhân giống cho đến khi đủ lượng giống cho sản xuẩt lớn. Tỷ lệ tiếp giống trong sản xuất lớn khoảng 1 – 5%. - Hiện nay, đã thiết kế những thiêt bị nuôi cấy tế bào đơn với dung tích hàng chục m3. Thiết bị lên men ở đây tương tự trong công nghệ vi sinh vật. Đối với các thiết bị nuôi cấy tế bào đơn không có hệ thống cung cấp oxygen mà chỉ có cánh khuấy, cần phải có hệ thống chiếu sáng đảm bảo cho quá trình tự dưỡng của tế bào xảy ra. - Trong khi tiến hành nuôi cấy, có thể tiến hành nuôi cấy theo chu kỳ (theo từng mẻ), cũng có thể nuôi cấy liên tục như trong kỹ thuật nuôi cấy và lên men vi sinh vật. - Huyền phù tế bào sau khi kết thúc quá trình nuôi cấy được đem đi ly tâm. Sản phẩm bậc 2 (taxol) ở trong dung dịch ly tâm. Áp dụng những phương pháp hóa lý tương ứng để tách các sản phẩm này ra khỏi dung dịch và đem tinh chế thì sẽ thu được sản phẩm bậc 2 (taxol). Hiện nay, phương pháp này đang được ứng dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Pháp, Canada, Mỹ, Hà Lan… có thể sử dụng phương pháp này để nuôi cấy tế bào trần. Đặc biệt, "Trong thời gian sắp tới, sẽ tiếp tục tiến hành thử nghiệm hình thức nuôi cấy tế bào thông đỏ dạng bioreactor ("lắc lớn") trong môi trường lỏng để có thể tạo nguồn nguyên liệu tách chiết taxol một cách nhanh chóng: Cứ 32.000 lít vừa tế bào vừa dung dịch được nuôi cấy dạng bioreactor sẽ thu được 1kg taxol". Phần 3: Kết luận: Thông đỏ là một nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá chúng ta cần phải có những biện pháp bảo tồn nguồn gen này một cách hợp lý. Cần tiến hành đa dạng các phương pháp nuôi cây tế bào đơn để thu được những sản phẩm thứ cấp có giá trị kinh tế cao và đáp ứng nhu cầu cuộc sống cũng như việc sử dụng taxol để điều trị bệnh ung thư ( từ thông đỏ). Tài liệu tham khảo Công nghệ tế bào - Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thuỷ Tiên.